THÔNG TIN CHUNG - Nhiễm sắc thể

Phân tích nhiễm sắc thể bằng phương pháp colchicine[11/11/2015]

1. Xử lý Colchicine.

Cá được tiêm Colchicine vào xoang bụng hoặc cơ trên đường bên. Nồng độ 0,2-0,4% với liều lượng 0,5-1,0ml cho 100g trọng lượng cá. Sau khi tiêm cá được giữ trong nước giàu oxy bằng cách cho nước chảy hoặc thổi khí liên tục. Thời gian giữ cá khoảng 5-8 giờ.

2. Xử lý nhược trương.

Sau khi xử lý Colchicine đủ thời gian, cá được mổ lấy toàn bộ hoặc một phần thận. Loại bỏ màng đen bám trên thận, cắt nhỏ thận đưa vào cối nghiền cùng với dung dịch nhược trương KCl (có nồng độ 0,75%). Giót mẫu từ cối nghiền sang ống nghiệm ly tâm, bổ xung thêm dung dịch nhược trương sao cho dung dịch lớn hơn mẫu 7-10 lần khối lượng của mẫu. Đặt ống nghiệm chứa mẫu lên giá đỡ, đưa vào tử ấm 370C. Sau 5 phút ly tâm với vận tốc 1500-2000 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút. Loại bỏ dung dịch nhược trương cũ thay vào lượng dung dịch mới tương đương, lắc đều mẫu, tiếp tục giữ trong tủ ấm 370. Thay dung dịch nhược trương 3-4 lần, thời gian nhược trương khoảng 45-60 phút.

3. Cố định mẫu.

Sau khi mẫu nhược trương đủ thời gian ta thay dung dịch nhược trương bằng dung dịch cố định (gồm 3 Ethanol : 1 Acid Acetid) với lượng tương đương. Ly tâm mẫu với tốc độ 1500-2000 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút. Loại bỏ dung dịch cũ thay vào một lượng tương đương dung dịch cố định mới, lắc đều mẫu giữ mẫu trong tủ lạnh ở 40C tối thiểu 2 giờ mới lên tiêu bản.

4. Lên tiêu bản.

Mẫu cố định đủ thời gian tiến hành lên tiêu bản. Ly tâm loại bỏ dung dịch cố định cũ, thay vào đó lượng dung dịch cố định mới gấp hai hoặc ba lần khối lượng mẫu. Lắc đều mẫu tạo khối dịch huyền phù tế bào. Để mẫu tự lắng sau 1-2 phút, dùng ống hút dịch huyền phù tế bào nhỏ lên lam kính đã được làm sạch, hút hết dịch thừa trên lam. Sau khi nhỏ mẫu, để tiêu bản tự khô hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho khô.

5. Nhuộm mẫu.

Sau khi tiêu bản khô, tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm gemsa trong hệ dung dịch đệm Natrihypophotphat (Na2HPO4.12H2O-23,956% hoặc Na2HPO4.2H2O-11,860%) và Kalihypophotphat (KH2PO4 - 9,078%). Các dung dịch đệm chỉ được trộn lẫn với nhau khi nhuộm tiêu bản. Tuỳ thuọc vào dung tích cốc nhuộm mà pha thuốc nhuộm cho thích hợp. Với cốc nhuộm 150ml có thể pha như sau:

4,5ml thuốc nhuộm + 50ml Na +50ml Ka.

Dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều hỗn hợp thuốc nhuộm. Rửa qua tiêu bản bằng nước sạch trước khi xếp tiêu bản vào cốc nhuộm. Thời gian nhuộm từ 20-25 phút. Sau khi nhuộm, tiêu bản được rửa bằng nước sạch cho hết thuốc nhuộm trên bề mặt lam kính. Để tiêu bản tự khô rồi tiến hành phân tích.

6. Phân tích tiêu bản.

6.1. Chụp ảnh phiến trung kỳ.

Tiêu bản được phân tích sơ bộ trên kính hiển vi ánh sáng điện. Chọn những phiến trung kỳ riêng rẽ, các nhiễm sắc thể tách biệt nhau, có hình thái rõ ràng để chụp ảnh. Ảnh các phiến trung kỳ được chụp qua máy ảnh chuyên dụng với vật kính có độ phóng đại 100 lần và thị kính có độ phóng đại 10 lần.

6.2. Xác định hình thái và số lượng nhiễm sắc thể.

Đếm số lượng nhiễm sắc thể của 50 phiến trung kỳ trên kính và 50 phiến trung kỳ trên ảnh chụp. Xác định kích thước nhiễm sắc thể bằng trắc vi thị kính. Xác định tỷ lệ giữa vai dài và vai ngắn của các nhiễm sắc thể bằng cách đo trực tiếp trên ảnh phiến trung kỳ.

6.3. Phân loại nhiễm sắc thể.

Dựa vào phương pháp phân loại hình thái nhiễm sắc thể của Levan và các cộng sự. Các nhóm hình thái nhiễm sắc thể được xác định theo tỷ lệ giữa vai dài và vai ngắn. Nấu ký hiệu vai dài là “q” và vai ngắn là “p”, các nhóm hình thái sẽ như sau:

Khi    1 £ q/p < 1,7 thuộc nhóm tâm cân (Metacentric - M)

Khi 1,7 £ q/p < 3,0 thuộc nhóm tâm lệch (Submetacentric - Sm)

Khi 3,0 £ q/p < 7,0 thuộc nhóm tâm lệch mút (Subtelocentric - St)

Khi 7,0 £ q/p đến vô cùng hoặc p=0 thuộc nhóm tâm mút (Telocentric - T)

Nguồn tin: Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1
Lượt xem: 563

ĐƠN VỊ CHỦ TRÌ

anh

CÁC ĐỐI TÁC

anh anh anh anh anh

LIÊN KẾT WEBSITE