THÔNG TIN CHUNG - Báo cáo

Báo cáo_Đánh giá khả năng sinh trưởng của các loài vi tảo sau thời gian lưu giữ[14/12/2021]

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN I

TRUNG TÂM QUỐC GIA GIỐNG HẢI SẢN MIỀN BẮC

 

 

 

BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CÁC LOÀI VI TẢO SAU THỜI GIAN LƯU GIỮ

  

 

 

  

Cát Bà tháng 12/2021


 

PHẦN I. MỞ ĐẦU

  1. Tính cấp thiết của chuyên đề

Lưu giữ giống vi tảo chính là bảo quản vi tảo liên tục trong những điều kiện môi trường có kiểm soát nhằm duy trì những dặc điểm vốn có của giống loài. Quá trình lưu giữ được thực hiện theo định kỳ bằng kỹ thuật vi sinh vô trùng và sử dụng chất bảo quản vào cuối pha tăng trưởng của vi tảo. Điều này có nghĩa là trong môi trường giữ giống các hoạt động của vi tảo vẫn diễn ra xong bị hạn chế, theo thời gian bảo quản giữ lại những tế bào có sức chịu đựng tốt nhất trước khi đưa giống trở về trạng thái tối ưu ban đầu. Tuy nhiên, quá trình sống sót của quần thể tảo lưu giữ có sự phụ thuộc vào trạng thái của tế bào trong từng pha sinh trưởng của chu kỳ nuôi. Điều này phụ thuộc rất lớn vào tình trạng dinh dưỡng của quần thể vi tảo trước khi vào trạng thái bảo quản tĩnh.

      Hiện nay, quá trình giữ giống vi tảo lâu dài được thực hiện trên những nước phát triển có thiết bị và đầu tư trang bị hiện đại cũng như có trình độ nghiên cứu chuyên sâu, điều này hầu như các nước khác áp dụng rất khó khăn do thực tiễn còn nhiều hạn chế. Chính vì vậy, sức sống của vi tảo giống theo thời gian bị giảm hay nói cách khác là thoái hóa giống. Nếu quá trình lưu giữ giống và quá trình nhân nuôi sinh khối diễn ra không đồng bộ và thiếu cụ thể sẽ diễn ra tình trạng giống sau khi lưu giữ nhân nuôi trở lại trong điều kiện không phù hợp sẽ bị chết, gây thiệt hại tới kinh tế cho người sử dụng. Mặt khác một số nước có ngành thủy sản phát triển vẫn thường xuyên thực hiện quá trình di nhập giống vi tảo từ các ngân hàng vi tảo trên thế giới. Tuy nhiên, chi phí cho quá trình mua giống vi tảo cũng như vận chuyển rất cao, đồng thời việc đảm bảo giống trở lại trạng thái nguyên đặc tính rất khó khăn nếu như cách tiến hành ban đầu không phù hợp. Điều này dẫn tới hậu quả giống vi tảo mua về bị chết hoặc sức sống bị giảm đi.

Các hình thức cơ bản lưu giữ giống tại Việt Nam hiện nay vẫn là: lưu giữ giống vi tảo trên thạch agar dinh dưỡng, lưu giữ vi tảo lỏng trong các bình tam giác. Hai hình thức lưu giữ giống này chủ yếu chọn giống qua hình thái của tế bào, mặc dù vẫn giữ được giống qua thời gian, nhưng việc chọn lọc gặp nhiều khó khăn đặc biệt là tốn rất nhiều thời gian

 Những khó khăn về đầu tư trang thiết bị, phương pháp sử dụng làm giảm hiệu quả trong lưu giữ giống và nuôi sinh khối vi tảo. Tiêu biểu cho những hạn chế đó là chất lượng vi tảo giống lưu giữ còn thấp, hiện tượng bị tạp nhiễm bởi một số loài tảo không mong muốn vẫn có khả năng xảy ra. Đặc biệt hạn chế lớn nhất trong khâu lưu giữ giống vi tảo của chúng ta là khó khăn trong việc duy trì giống tảo gốc trong thời gian dài. Việc nuôi sinh khối vi tảo trong các trại sản xuất còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường đặc biệt là nhiệt độ và ánh sáng. Sự thay đổi của các yếu tố môi trường thường hạn chế khả năng phát triển của vi tảo nuôi sinh khối thậm chí làm cho tảo nuôi sinh khối chết hàng loạt ảnh hưởng đến ương nuôi giống hải sản.. Chính vì vậy, giống vi tảo sau khi được chọn lọc đảm bảo phát triển một cách toàn diện, ưu thế và đầy đủ nhất. Sau khi giống được chọn lọc trong quá trình lưu giữ, một bước quan trọng không thể thiếu trước khi đưa giống trở lại nuôi trong điều kiện nuôi sinh khối lớn chính là thực nghiệm kiểm chứng giống trong phòng thí nghiệm. Giống sau khi được nuôi thử nghiệm và nuôi đạt trạng thái ổn định mới chuyển ra bên ngoại nuôi thực tế.

Trên cơ sở những vấn đề đặt ra, chúng tôi thực hiện chuyên đề:Đánh giá khả năng sinh trưởng của các loài vi tảo sau thời gian lưu giữ”

Mục tiêu nghiên cứu

Duy trì và kiểm xoát chất lượng nguồn giống vi tảo thuần hiện có, sẵn sàng cung cấp nguồn tảo giống thuần cho các đơn vị sử dụng

Nâng cao hiệu quả nuôi sinh khối vi tảo cũng như đảm bảo sinh khối vi tảo làm thức ăn ương trong các công nghệ sản xuất giống.

Cung cấp thêm các dẫn liệu khoa học nhằm từng bước hoàn thiện quy trình kĩ thuật lưư giữ và nhân nuôi sinh khối thực vật phù du của Trung tâm.

Nội dung nghiên cứu

- Lưu giữ an toàn 5 nguồn gien vi tảo biển: Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros muelleriThalassiosira pseudonana.

- Đánh giá chất lượng 5 nguồn gien vi tảo được lưu giữ trên trong điều kiện nhân nuôi sinh khối trở lại.

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.  Đặc điểm sinh học

2.1.1. Nannochoropsis oculata

2.1.1.1. Phân loại

Dựa theo hệ thống phân loại của Van Den Hoek (1995) đã xác định:

Ngành: Heterokontophyta

     Lớp: Eustigmatophyceae

           Bộ: Eustigmatales

                Họ: Eustigmatos

                      Chi: Nannochloropsis

                          Loài: Nannochloropsis  oculata (Droop) Hibber-1981                          

2.1.1.2. Hình thái

N. oculata đơn bào, dạng khối cầu hoặc hơi hình trứng, kích thước dài
2 -  4µm, không có roi nên không có khả năng tự di động trong môi trường sống . Trong môi trường nuôi tế bào sống ở dạng trôi nổi và trạng thái lơ lửng khi môi trường không có sục khí.

2.1.1.3. Cấu tạo

Năm 1986, Murayama đã nghiên cứu cấu trúc hiển vi của tế bào
N. oculata dưới kính hiển vi điện tử cho thấy, tế bào có một nhân. Thể sắc tố quang hợp chỉ có một thể sắc tố hình trứng. Thể sắc tố được bao bọc bởi hai lớp màng, lớp màng ngoài dính liền với màng nhân. Trong thể sắc tố có nhiều bản sắc tố, mỗi bản sắc tố gồm 3 phiến sắc tố xếp song song nhau, không có đai nối giữa các phiến sắc tố. Sắc tố quang hợp duy nhất tìm thấy ở N. oculata là Chlorophyl a, không có sắc tố quang hợp Chlorophyl b và c. Đây được coi là một đặc trưng sinh hoá chủ yếu để phân loại Nannochloropsis nói riêng và ngành Eustigmatophyta nói chung, ngành chỉ có Chlorophyl a mà không có Chlorophyl b và c. Các carotenoid bao gồm carotene 11%, violaxathin 51%, vaucheriaxanthin 26%, và các carotenoid khác chiếm 12%.

2.1.1.4.  Sinh trưởng

Ánh sáng: với vi tảo, ánh sáng rất cần thiết cho quá trình quang hợp vì chúng là nguồn năng lượng để có thể chuyển hoá các chất vô cơ thành các chất hữu cơ cần thiết cho quá trình sống. Theo Hoff và Snell (1999) cường độ ánh sáng 1000 – 5000lux và chu kỳ quang giờ sáng/tối là 16/8 hoặc 24/0 là phù hợp nhất cho sinh trưởng của N. oculata.

Nhiệt độ: theo Hoff và Snell (1999) N. oculata là loài có khả năng thích nghi với sự biến động về nhiệt độ rộng, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 20 – 30oC. Tuy nhiên, Liao và cs (1991) cho biết N. oculata sinh trưởng kém nếu nhiệt độ dưới 16oC hoặc trên 28oC; ở nhiệt độ 22 – 26oC với điều kiện dinh dưỡng tốt, cường độ ánh sáng phù hợp thì loài vi tảo này phát triển rất nhanh.

Độ mặn: cũng theo Hoff và Snell (1999) N. oculata có thể sinh trưởng được trong khoảng dao động lớn của độ mặn từ 0 - 36‰. Bên cạnh đó, nghiên cứu của Phạm Thị Lam Hồng (1999) cho kết quả sinh trưởng tốt nhất của tảo N. oculata ở độ mặn 30 – 35 ‰, nhưng có thể phát triển ở độ mặn 10 – 35 ‰. Tuy nhiên, theo Vũ Dũng (1998)  N. oculata phát triển tốt ở độ mặn 18 – 26 ‰.

pH: phát triển được trong khoảng 6,4 – 9,6 nhưng tối ưu là 7,8 – 8,2 và thay đổi theo tốc độ sinh trưởng của N. oculata. Nếu tốc độ sinh trưởng càng nhanh thì pH càng tăng nhanh thuận chiều với quá trình lấy CO2 trong nước.

2.1.1.5. Sinh sản

N. oculata sinh sản bằng cách phân đôi cơ thể từ một tế bào mẹ cho hai tế bào con giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu. Khi mới phân chia xong tế bào của chúng nhỏ hơn bình thường nên dựa vào đặc điểm này mà ta có thể biết được tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh sản của quần thể vi tảo đang nuôi.

2.1.2. Isochrysis galbana

2.1.2.1. Phân loại

Dựa theo hệ thống phân loại của Van Den Hoek (1995), đã xác định:

Ngành: Haptophyta

      Lớp: Haptophyceae

            Bộ: Isochrysidales

                   Họ: Isochrysidaceae

                          Chi: Isochrysis

                                 Loài: Isochrysis galbana Parke 1949

2.1.2.2. Hình thái

I. galbana sống đơn bào, hình thoi dài hoặc hình tròn. Kích thước tế bào dài khoảng 5 – 7µm. Vi tảo có hai roi bằng nhau hoặc gần bằng nhau, sợi bám ngắn thường hay biến mất, mỗi roi dài khoảng 7µm nên chúng có khả năng di động nhanh trong nước theo kiểu quay tròn tịnh tiến.

2.1.2.3. Cấu tạo

Thể lục lạp của I. galbana có dạng hình chén và chiếm khoảng 1/3 thể tích của tế bào. Sắc tố chủ yếu I. galbana là Chlorophyl a, c, Carotenoid chứa nhiều fucoxanthin đặc trưng nên khi quan sát trên kính hiển vi điện tử các tế bào I. galbana có màu vàng đậm đến màu nâu nhạt. Chính vì vậy, một số tác giả xếp I. galbana vào lớp tảo vàng ánh.

2.1.2.4. Sinh trưởng

Ánh sáng: theo Frank H. Hoff và Terry W. Snell (1987) thì I. galbana có thể chịu được cường độ chiếu sáng từ 2500 – 10000 lux nhưng tốt nhất ở ánh sáng 5000 – 8000 lux . Trong điều kiện không có ánh sáng kết hợp với để ở nhiệt độ thấp thì I. galbana dễ bị tàn. Vì thế để đảm bảo rằng việc nuôi sinh khối cũng như lưu giữ giống loài vi tảo này đạt hiệu quả cao cần phải chiếu sáng liên tục trong ngày.

Nhiệt độ: Frank H. Hoff và Terry W. Snell (1987) thì I. galbana có ngưỡng nhiệt độ tối ưu là 250 – 300C. Đây là loài khó thích nghi được với điều kiện nhiệt độ thấp, nếu đưa các tế bào vi tảo này vào nhiệt độ dưới 100C chúng chỉ sống được một thời gian rất ngắn hoặc có thể bị chết

Độ mặn: phù hợp nhất cho I. galbana phát triển vẫn là 10 – 30‰.

pH: I. galbana có thể thích nghi được điều kiện pH thấp hơn N. oculata nhưng phù hợp nhất trong khoảng từ 5 – 9.

2.1.2.5. Sinh sản

I. galbana cũng theo hình thức phân cắt làm hai tế bào con giống tế bào mẹ ban đầu. Điều đặc biệt của I. galbana là khi sinh sản một đầu tế bào thường to hơn đầu còn lại và xuất hiện eo phân cắt ở giữa tế bào nên rất dễ nhận thấy khi quan sát dưới kính hiển vi.

2.1.3 Chaetoceros calcitrans

2.1.3.1 Phân loại

Ngành Heterokontophyta

Lớp Bacillariophyceae

Bộ Coscinodiscales     

Họ Chaetocerotaceae

Chi Chaetoceros

Loài Chaetoceros calcitrans Pausen, 1905

2.1.3.2 Hình thái

Theo S.W. Jeffrey, M.R. Brown and C.D. Garland (1994) mô tả, tế bào của C. calcitrans có dạng hình hộp lồng, tế bào hình vuông hoặc hình chữ nhật. Ở 4 góc có 4 gai tương đối dài. Kích thước tế bào tảo C. calcitrans từ 3 - 6µm. Thường sống đơn độc.

2.1.3.3 Cấu tạo

Tế bào gồm hai mảnh vỏ (lớp trong là pectin, lớp ngoài là dioxyd silic (SiO2. 7H2O)), có cấu trúc như hai nắp của cái hộp lắp vào nhau, bên trong chứa tế bào chất (Đặng Thị Sy, 2005). Có khả năng di động nhờ nội chất chuyển động trong các khe trên thành tế bào. Thành phần sắc tố có diệp lục a, c, caroten và xanthophin.

2.1.3.4 Sinh trưởng

      Nhiệt độ: theo Brown (1994) C. calcitrans phát triển khá tốt trong khoảng nhiệt độ 10-30oC. C. calcitrans hầu như không phát triển hoặc rất chậm trong điều kiện dưới 10oC, phát triển tốt trong khoảng nhiệt 15-25oC.

      Độ mặn: Brown (1994) cho biết C. calcitrans có giới hạn chịu độ mặn rộng trong khoảng 7-35‰. Tuy nhiên, C. calcitrans phát triển tốt ở độ mặn 21-35‰.

pH: thay đổi theo tốc độ phát triển của vi tảo nhưng pH tốt nhất cho sự phát triển của vi tảo là 8,2 – 8,7.

2.1.3.5 Sinh sản

Sinh sản dinh dưỡng là chủ yếu, khi sinh sản nội chất của tế bào phân đôi đồng thời hai mảnh vỏ tách ra mỗi nửa nội chất nhận một mảnh vỏ của tế bào mẹ, sau đó tự tổng hợp nên vỏ thứ hai (Đặng Thị Sy, 2005). Hai tế bào của thế hệ sau mới sinh ra nhỏ hơn tế bào mẹ ban đầu nhưng sau một thời gian sinh trưởng chúng phát triển đạt kích thước như tế bào mẹ ban đầu. Đôi khi có xảy ra hiện tượng sinh sản hữu tính nhưng thường rất hiếm vì phải đặt vào trong điều kiện bão hoà dinh dưỡng nuôi liên tục trong thời gian dài.

2.1.4. Chaetoceros muelleri

2.1.4.1 Phân loại

Ngành Bacillariophyta

      Lớp Centrophyceae

             Bộ Biddulphiales

Họ Chaetocerotaceae, Ralfs in Pritchard

Giống Chaetoceros, Ehrenberg

Loài Chaetoceros muelleri, Lemm.

2.1.4.2 Hình thái

      Tảo có dạng hình hộp lồng. Tế bào hình vuông, chữ nhật, 4 góc có 4 gai tương đối dài. Kích thước tảo nhỏ, giao động từ 3,5-4,6 × 4,5-9,2 µm. Thường sống thành từng tập đoàn dạng chuỗi nhờ các lông gai móc nối nhau, ít khi sống đơn độc (Đặng Thị Sy, 2005).     

2.1.4.3 Cấu tạo

      Tế bào gồm 2 mảnh cấu thành lớp trong là pectin lớp ngoài là chất silic. Hai mảnh vỏ có cấu trúc như 2 nắp của hộp lồng ghép vào nhau, bên trong chứa tế bào chất gồm các sắc tố: diệp lục a, c, caroten và xanthophin.

2.1.4.4 Sinh trưởng

      Ánh sáng: theo Frank H. Hoff và Terry W. Snell (1987) C. muelleri phất triển trong khoảng 8000 – 10000 Lux là tối ưu. Trong quá trình nuôi ánh sáng bị che lấp ngày càng nhiều khi mật độ tế bào ngày càng cao vì vậy cần phải sục khí liên tục để tốc độ sinh trưởng không bị gián đoạn.

      Độ mặn:cũng theo Frank H. Hoff và Terry W. Snell (1987) C. muelleri có giới hạn độ mặn khá cao 20 - 35‰. Khi độ mặn giảm dưới 15‰ tế bào gần như không phân chia hoặc bị vỡ tế bào.

      Nhiệt độ: Cũng giống như các loài tảo silic khác C. muelleri có ngưỡng nhiệt chịu đựng cao nằm trong khoảng 25 – 35oC. Khi nhiệt độ cao trên 30oC phải chú ý tới quá trình cung cấp dinh dưỡng để tránh sự phát triển nhanh mà thiếu hụt dinh dưỡng dẫn tới pha tăng trưởng giảm dần mật độ.     

2.1.4.5 Sinh sản

      Hình thức sinh sản dinh dưỡng vẫn là chủ yếu, khi sinh sản nội chất của tế bào phân đôi đồng  thời 2 mảnh vỏ tách ra mỗi nửa nội chất nhận 1 mảnh vỏ của tế bào mẹ rồi tổng hợp mới mảnh thứ hai (Đặng Thị Sy, 2005).

2.1.5 Thalassiosira pseudonana

2.1.5.1 Phân loại

    Ngành:Bacillariophyta

      Lớp Centrophyceae

             Bộ Discales        

Họ Thallassiosiraceae

Giống Thalassiosira

Loài Thalassiosira pseudonana

2.1.5.2 Hình thái

      T. pseudonana thuộc bộ tảo hình đĩa. Đây là loài sống  đơn độc hoặc theo tập đoàn. Tập đoàn tảo được tạo thành do các tế bào nối với nhau bằng mấu dạng ống hoặc sợi keo. Tế bào hình hộp tròn, mặt cắt ngang hình tròn. Mặt phẳng hoặc không. Kích thước trung bình từ 4-5 µm [Đặng Thị Sy, 2005].

2.1.5.3 Cấu tạo

      Tế bào có nhân lưỡng bội bao bọc bởi 2 mảnh vỏ có cấu trúc như hai nắp của một cái hộp lắp vào nhau. Trên bề mặt vỏ có những hoa văn xếp theo kiểu đối xứng toả tròn có quy luật hoặc không. Chúng có cánh màng nhầy dùng để liên kết tế bào với nhau.

      Nguyên sinh chất trong suốt làm thành lớp mỏng nằm ở phía dưới vách tế bào hay khối nhỏ ở trung tâm. Thành phần sắc tố gồm có diệp lục a, c, carotin và xanthophin. Sản phẩm đồng hoá cũng giống như các ngành trong nhóm sắc tố vàng là chrysolaminaran và dầu, thường tập trung thành từng giọt màu cam, ngoài ra còn có volutin cũng tập trung thành giọt nhưng có màu xanh lam.

2.1.5.4 Sinh trưởng

      Nhiệt độ: theo S.H. Baek, cs thì nhiệt độ để Thalassiosira pseudonana phát triển tốt nhất từ 20 – 30oC. Nhiệt độ thấp T. pseudonana phát triển kém nhất là khi ánh sáng yếu tảo bị sốc và đổi màu.

      Độ mặn: T. pseudonana chịu ngưỡng độ mặn cao tốt hơn khi độ mặn thấp. Tuy nhiên, độ mặn tới hạn nằm trong khoảng 15 - 35‰, tối ưu là 22 - 28‰.

      Ánh sáng: T. pseudonana chịu tác động mạnh bởi chu kỳ chiếu sáng và cường độ ánh sáng. Khi ánh sáng yếu tảo phát triển rất chậm, chu kỳ chiếu sáng không hợp lý làm tảo dễ bị sốc và chết. Tuy nhiên, cùng với nhiệt độ không quá cao thì đây là loài vi tảo có tính nhạy cảm với yếu tố ánh sáng.

2.1.5.5 Sinh sản

      Hình thức sinh sản dinh dưỡng là chủ yếu. Khi sinh sản nội chất của tế bào phân đôi, đồng thời hai mảnh vỏ tách ra, mỗi nửa nội chất nhận một mảnh vỏ của tế bào mẹ rồi tổng hợp mới mảnh thứ hai. Khi gặp điều kiện bất lợi tảo có thể hình thành bào tử nghỉ bằng noãn giao.

2.2 Tổng quan nghiên cứu về môi trường dinh dưỡng nuôi vi tảo

2.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi tảo biển

      Chất dinh dưỡng là yếu tố vô cùng quan trọng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo, quan trọng nhất chính là chất dinh dưỡng mà vi tảo được tích lũy trong quá trình nuôi. Để vi tảo phát triển mạnh, gia tăng mật độ cao nhất thì ngoài các yếu tố như độ mặn, nhiệt độ, ánh sáng có thể điều chỉnh theo thiết bị và dụng cụ, dinh dưỡng nước nuôi là yếu tố quyết định đến năng suất của vi tảo. Trong khi đó dinh dưỡng vi tảo được nâng cao hay giảm đi so với dinh dưỡng ban đầu ngoài tự nhiên là do dinh dưỡng mà vi tảo được nuôi. Mỗi loài vi tảo khác nhau có nhu cầu dinh dưỡng về từng thành phần và số lượng chất khác nhau.

      Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của vi tảo có thể chia ra làm hai thành phần chính là đa lượng và vi lượng. Trong đó,  thành phần đa lượng nuôi vi tảo bao gồm: muối của nito, photpho, silic (nếu là vi tảo silic sử dụng cho quá trình tạo nên vỏ ngoài của tế bào vi tảo). Thành phần vi lượng gồm một số ion kim loại cần thiết với hàm lượng thấp như Co (coban), Cu (đồng), Zn (kẽm), Mn (mangan), Fe (sắt).. và một số vitamin B1, B12, H...

      Nhu cầu các chất đa lượng trong công thức môi trường dinh dưỡng nuôi vi tảo biển tập trung chủ yếu là nito, photpho và silic. Cụ thể:

  1. Các muối nito thường được sử dụng là nito trong muối nitrite N- NO3 và N- NH4. Muối nito chính là thành phần quan trọng cấu tạo nên các protein và vitamin cung cấp cho vi tảo trong quá trình nuôi. Thông thường, nhu cầu nito của các loài tảo lục là cao nhất, nhu cầu nito thấp nhất với các loài vi tảo nâu (De Pauw và cs, 1983). Ví dụ: khi cường độ ánh sáng 2000 lux, nhu cầu nito với Chlorella sp. là 57mg/l, trong khi đó Nitzchia paka thích hợp là 5 – 10 mg/l, còn Chaetoceros calcitrans là > 10 mg/l (Utiing, 1985) .
  2. Nito là yếu tố thúc đẩy quá trình phát triển của vi tảo thì photpho chính là yếu tố giới hạn cho sự phát triển của vi tảo. Mặc dù, hàm lượng photpho không nhiều trong môi trường nuôi nhưng lại là chìa khóa của quá trình trao đổi chất của tế bào (Huckison, 1957, trích theo Trần Văn Vỹ, 1995). Theo Zyceb (1952) thì vi tảo silic, tảo lục và tảo lam phát triển mạnh ở hàm lượng photpho giới hạn từ 0,1 – 0,8 mg/l, nếu hàm lượng photpho này nhỏ hơn 0,005 mg/l thì vi tảo phát triển kém hoặc chết. Nhiều thí nghiệm cho thấy: trong quá trình nuôi vi tảo nước ngọt và vi tảo biển ở mức độ dinh dưỡng cao hơn đặc biệt là nito và photpho cóthể kéo dài tuổi thọ của vi tảo nuôi. Vấn đề này được Bischoff và Bold (1963) thử nghiệm trên một số vi tảo và kết quả kéo dài được chu kỳ sinh trưởng của vi tảo trong vòng vài tháng (Sato, 1991).
  3. Silic là yếu tố cấu tạo nên vách tế bào vi tảo đối với các loài vi tảo có cấu tạo vỏ bao gồm silicate, tế bào có xu hướng vỡ hoặc tách tế bào trong quá trình sinh trưởng thường gặp khó khăn nếu thiếu silic. Theo Gusep (1952), tảo silic phát triển tốt ở hạm lượng 1- 3 mg/l.

      Các nguyên tố vi lượng bao gồm các muối kim loại với nồng độ thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình trao đổi chất của vi tảo, quan trọng nhất là sắt. Sắt có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển điện tử, quan phân ly nước và quá trình photpho hóa quang hợp. Hàm lượng sắt cần cho quá trình sống của vi tảo nằm trong khoảng 2 – 3 mg/l với các loài vi tảo silic nhưng lại là mức có thể gây chết với một số loài khác.

      Vitamin bổ sung vào môi trường dinh dưỡng cho vi tảo nhằm mục đích tăng cường các hoạt động trao đổi chất của vi tảo bền bỉ hơn. Trong đó, vitamin thường sử dụng trong quá trình nuôi vi tảo biển bao gồm: B1, B12 và H (với các loài vi tảo có roi).

2.2.2 Một số nghiên cứu về môi trường dinh dưỡng của vi tảo trên thế giới

      Thực vật phù du có vai trò quan trọng trong chu trình sinh địa và trao đổi chất, chiếm tới 50% năng lượng sản xuất cho toàn trái đất (Fied và cs, 1998). Thông qua quá trình hấp thu của nhiều các yếu tố dinh dưỡng như nito (N), photpho (P) hoặc sắt  sẵn có trong nước để tạo ra nhiều các chu kỳ sống khác nhau trong tự nhiên.

      Năm 1890 Beijerin là người đã tiến hành phân lập và nuôi tảo thuần sạch đầu tiên trên thế giới, đánh dấu nhiều công trình nghiên cứu tìm ra môi trường nuôi cho các loài vi tảo và các phương pháp nuôi thu sinh khối vi tảo sau đó. Sau vài thập niên, cùng với sự phát triển của việc sản xuất giống cũng như nuôi tôm biển trên một số nước đạt được thành công kéo theo những nghiên cứu về việc sử dụng vi tảo biển nhằm tăng tỷ lệ thành công trong các quy trình trên. Sớm nhất, 1946 tiến sĩ Hudinaga đã đề cập tới việc nuôi vi tảo bằng 2 phương pháp khác nhau nhằm thu được lượng vi tảo sinh khối cao nhất cho việc nuôi ấu trùng tôm bao gồm:

  1. từ môi trường là nước biển tự nhiên, các loài vi tảo cần thiết được phân lập và nuôi trong môi trường có bổ sung chất dinh dưỡng, chiếu sáng và có sục khí. Loài vi tảo nuôi được chọn chủ động ngay từ ban đầu và loại bỏ những loài còn lại. Trong phương pháp này, Hudinaga đã chọn được Skeletonema costatum dùng cho ấu trùng tôm.
  2. Phương pháp ‟cảm ứng nở hoa” sử dụng nước biển lọc thô, chỉ giữ lại một số loài vi tảo có sẵn trong nước để làm giống, có bổ sung phân vô cơ, chiếu sáng cho vi tảo phát triển. Tuy nhiên, phương pháp này không chủ động được sinh khối nuôi do khí hậu thay đổi thường xuyên.

      Năm 1965 Glancy thực hiện nuôi vi tảo biển chỉ bằng phương pháp lọc thô nước biển bằng túi vải bông dày và chờ vi tảo phát triển mà không hề bón thêm bất cứ chất dinh dưỡng nào. Tuy nhiên, ngay cả phương pháp của Hudinaga cũng mang lại hiệu quả không cao. Kết quả của các phương pháp trên chỉ thu được một số loài vi tảo nhất định, do không thuần chủng và dinh dưỡng nuôi chưa phù hợp nên không duy trì được loài vi tảo thu thập được từ tự nhiên trong thời gian dài.

      Sau sự ra đời của môi trường dinh dưỡng của F/2 (Guillard & Ryther, 1962) là hàng loạt các nghiên cứu về môi trường dinh dưỡng được ra đời trong đó có: Walne (1970), môi trường cải tiến của Liao và Huang (1983), môi trường của Allen – Nelson, môi trường của Erd – Schreiber... Những nghiên cứu này sử dụng chung cho hầu hết các loài vi tảo mà không đặc biệt tập trung cho bất cứ loài vi tảo riêng biệt nào.

      Các thí nghiệm của Rhee (1978) cho thấy: tốc độ tăng trưởng của thực vật phù du có ảnh hưởng bởi tỷ lệ N : P, tốc độ tăng trưởng cao khi tỷ lệ N : P cao trong một phạm vi hẹp giới hạn giá trị và khi tốc độ tăng trưởng của thực vật phù du thấp phản ánh giới hạn của P (N cao : P) hoặc N giới hạn (thấp N : P), tỷ lệ N : P trong môi trường dinh dưỡng phụ thuộc vào từng loài vi tảo riêng biệt.

      Theo Chen (1995) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của tỷ lệ N/P tới 5 loài vi tảo biển khi sử dụng hai nguồn nitrogen có trong NH4Cl và nitrogen có trong urea với nguồn photpho có trong NaH­2PO4 thu được tỷ lệ N/P tối ưu ở các loài nghiên cứu như sau: Thalassiosira sp. là 30/1 và 20/1; Heterosigma akashiwo đều là 30/1; Chroomonas salina là 20/1 và 30/1, Chaetoceros gracilis là 40/1 và 60/1 và Alexandrium sp. là 10/1 và 30/1. Có thể nhận thấy, tỷ lệ N/P cao hơn so với những nghiên cứu về tỷ lệ N/P của Redfield là 16/1.

      Nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cho thấy thực vật phù du thích nghi tốt với tỷ lệ N/P nằm trong khoảng từ 5 – 7. Tuy nhiên, tỷ lệ này lại phụ thuộc vào hàm lượng các chất có sẵn trong nguồn nước và nhu cầu tế bào thực vật phù du cần. Vi tảo nước mặn được nghiên cứu trung bình của 29 loài đã cho ra kết luận tỷ lệ N/ P trung bình là 17,7, gần bằng tỷ lệ N/P mà Redfied công bố. Và, trung bình tỷ lệ N/P mà vi tảo biển cần nằm trong khoảng 7,1 – 43,3  mà không bao gồm cấu tạo tế bào của chúng.

      Những nghiên cứu về việc sử dụng môi trường dinh dưỡng cho quá trình phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối chủ yếu dựa vào những công thức chuẩn sẵn có đã được công bố: F/2 ( năm công bố 1962), Walne ( năm công bố 1966), Provasoli ES (năm công bố 1968)...trên thực tế do chất lượng nước thay đổi nên các thành phần dinh dưỡng tự nhiên trong nước cũng thay đổi theo. Chính vì vậy, trong quá trình sử dụng các công thức môi trường dinh dưỡng cần phải được điều chỉnh cho phù hợp nhằm đảm bảo hiệu quả quá trình phân lập, giữ giống và nuôi sinh khối tốt nhất.

      Trên thực tế, hiện nay đang sử dụng công thức dinh dưỡng nuôi vi tảo biển trong điều kiện thuần gốc các loài thường sử dụng các muôi dinh dưỡng có nito và photpho cho tỷ lệ N/P nhỏ hơn tỷ lệ của Redfied sử dụng nhằm kéo dài chu kỳ sống của quá trình nuôi vi tảo. Tuy nhiên, do tính chất nước thay đổi theo từng vùng biển cũng như theo mùa nên quá trình điều chỉnh dinh dưỡng chủ yếu của 2 thành phần nito và photpho luôn phải diễn ra nhằm thích ứng cho quá trình sống của vi tảo được tồn tại.

2.2.3. Việc sử dụng môi trường dinh dưỡng nuôi vi tảo tại Việt Nam

      Sự phát triển các hoạt động thủy sản tại Việt Nam chậm hơn các nước phát triển khác trong khu vực: Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan...nên Việt Nam được thừa hưởng nhiều thành quả nghiên cứu trước đó để áp dụng trong thực tiễn nhằm đạt hiệu quả kinh tế cao hơn.

      Năm 1974, Vũ Dũng đã phân lập được loài Skeletonema costatum bằng ống hút mao quản trên kính hiển vi và nuôi nhân sinh khối ở môi trường Alen nelsson thành công. Từ năm 1975 – 1981, Vũ Dũng và Vũ Văn Toàn đã tiến hành hàng loạt các thí nghiệm chọn lọc môi trường và một số điều kiện sinh thái cho một số đối tượng vi tảo silic phục vụ cho quy trình sản xuất tôm giống. 1982 cũng chính 2 tác giả trên đã bổ sung thêm hàng loạt các công trình nghiên cứu mới trên một số loài vi tảo xanh và vi tảo vàng nhằm hoàn thiện phục vụ cho sản xuất giống hải sản. Cùng thời điểm, Lê Viễn Chí cũng đã thuần hóa và chọn lọc ra môi trường nuôi thích hợp cho Ch. pyrenoidisa.

      Năm 1977 – 1979, tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, Trần Văn Vỹ và Trần Thị Tho lưu giữ được 2 loài ChlorellaScenedesmus trong phòng thí nghiệm khi sử dụng môi trường 04 cải tiến, môi trường Pratt thuần khiết đạt được mật độ tế bào ban đầu nuôi cao hơn ngoài tự nhiên.

      Năm 1995, Đặng Đình Kim và cs tại Viện công Nghệ Sinh học Hà Nội đã sử dụng thiết bị nuôi tăng tốc trong phòng thí nghiệm, để sản xuất giống vi tảo lục Chlorella sp. bằng dung dịch nuôi dưỡng là muối Na, N, K, P đơn giản có bổ sung thêm sắt. Mật độ vi tảo đạt được từ 40 – 50 triệu tb/ml.

      Vài năm trở lại đây, cùng với sự phát triển của các quy trình sản xuất giống và nuôi thương phẩm của một số đối tượng lâu năm, theo quy mô rộng lớn hơn cũng như một số đối tượng hải sản mới, đã đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu và sử dụng giống vi tảo trong cả nước. So với miền Bắc thì ở miền Nam nước ta có nhiều thuận lợi hơn để phát triển vi tảo do: số ngày nắng nóng trong năm cao, độ ẩm thấp và biên độ giao động nhiệt độ nhỏ. Chính vì vậy, việc thuần hóa vi tảo tự nhiên sử dụng cho các đối tượng hải sản tiến hành dễ dàng hơn và đạt được nhiều thành quả hơn.

      Hiện nay, số công trình nghiên cứu về nuôi và sử dụng vi tảo làm thức ăn cho từng loài riêng biệt còn rất ít. Công nghệ nuôi và lưu giữ giống không ổn định, đa số các cơ sở sản xuất còn thiếu giống thuần chủng hoặc thiếu thiết bị nuôi cũng như lưu giữ giống. Vì vậy, quy trình sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm của các đối tượng hải sản chưa đạt hiệu quả như mong muốn. Vì vậy, cần có những nghiên cứu xây dựng hoàn thiện các quy trình lưu giữ giống, nuôi sinh khối nhằm chủ động cung cấp thức ăn cho các cơ sở nuôi hải sản.

 

 

PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

3.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là 5 loài vi tảo: Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros muelleri, Thalassiosira pseudonana. Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Quốc gia giống Hải sản miền Bắc Cát Bà - Hải Phòng.

- Thời gian thực hiện: từ tháng 01/01/2021 đến tháng 31/12/2021

3.2. Phương pháp thực hiện

3.2.1 Các phương pháp chung

+ Vi tảo giống:

5 loài vi tảo N. oculata, I. galbana, C. calcitrans, C. muelleri và T. pseudonana sau khi nhập giống vào Trung tâm Quốc gia giống Hải sản miền Bắc được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm đảm bảo sống sót và phát triển được. Sau đó, vi tảo giống được kiểm tra trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần để xác định đúng chủng loại trước khi đưa vào quá trình giữ giống (kích thước, mầu sắc, độ thuần). Giống đạt yêu cầu về độ thuần thì tiến hành quá trình lưu giữ bằng 2 phương pháp trong môi trường lỏng và trên thạch.

+ Xử lý nước thí nghiệm:

      Nước biển được sử dụng cho quá trình lưu giữ và nuôi cấy trở lại được lấy từ nguồn nước biển tự nhiên có độ mặn 27‰. Sau khi bơm, nước biển được đi vào hệ thống các ao chứa, chảy vào các ao lắng, được bơm lên bể lọc của hệ thống lọc cát cơ học, sau đó nước biển được lọc qua hệ thống lọc catrige từ 10µ, 1µ và lọc bằng lõi lọc cacbon trước khi đi vào quá trình xử lý nước nuôi cấy.

      Nếu sử dụng cho quá trình lưu giữ và cấy giống trong các bình thuỷ tinh thì nguồn nước biển qua hệ thống lọc trên được tiệt trùng bằng cách đun sôi. Nếu sử dụng cho quá sinh nuôi sinh khối giống thứ cấp thì nguồn nước biển qua hệ thống lọc trên được xử lý bằng chlorine có nồng độ 100ppm và trung hoà nguồn nước sau 24 giờ xử lý bằng thiosulphat có nồng độ tương ứng nồng độ chlorine xử lý.

+ Pha chế môi trường:

      Bảng 2: Công thức môi trường F/2 Guillard & Ryther năm 1962 (pha trong 1 lít)

STT

Công thức hóa chất

Đơn vị

Số lượng

1

NaNO3

mg

150

2

NaHPO4

mg

8,69

3

Ferric EDTA

mg

10

4

MnCl2

mg

0,22

5

CoCl2

mg

0,11

6

CuSO4.5H2O

mg

0,0196

7

ZnSO4.7H2O

mg

0,044

8

Na2SiO3.9H2O

mg

60

9

Na2MoO4.2H2O

mg

0,012

10

B12

µg

1,0

11

Biotin

µg

1,0

12

Thiamine HCL

mg

0,2

      Để đơn giản và thuận tiện cho việc pha chế môi trường nuôi, các dung dịch gốc có nồng độ đậm đặc được chuẩn bị riêng rẽ trong các bình thuỷ tinh tối mầu nhằm sử dụng lâu dài. Từng thành phần đa lượng, các kim loại vi lượng được pha riêng và nồng độ pha gấp 1000 lần công thức môi trường. Lượng dùng: 1ml mỗi dung dịch gốc cho 1 lít nước nuôi. Tất cả các dung dịch gốc đều được đun sôi tiệt trùng và bảo quản trong điều kiện lạnh, tối, duy trì chất lượng và sử dụng trong vòng thời hạn 3 tháng. Trước khi sử dụng môi trường dinh dưỡng cho quá trình nuôi cấy bổ sung vitamin khi cần thiết.

+ Vệ sinh dụng cụ thí nghiệm

      Các dụng cụ chuẩn bị cho quá trình lưu giữ làm từ vật liệu thuỷ tinh (bình tam giác 100ml, bình tam giác 250ml) được tiệt trùng bằng tủ sấy dụng cụ ở nhiệt độ 121oC theo 3 chu kỳ tự động. Các dụng cụ phục vụ cho quá trình lưu giữ và nuôi giống thứ cấp (bình thuỷ tinh tam giác 1 L, bình cầu 2 L, bình cầu 5 L và bình cầu 10 L) được tiệt trùng đồng thời trong quá trình đun nước biển để nuôi cấy trở lại.

      Các bình nhựa 20L, ống thủy tinh thổi khí dùng để nuôi sinh khối được rửa sạch và tiệt trùng đồng thời với quá trình tiệt trùng nước nuôi bằng chlorine có nồng độ 100ppm.

+ Xác định mật độ tế bào:

Mật độ tế bào là chỉ tiêu đánh giá quá trình sinh trưởng của quần thể vi tảo theo thời gian. Mật độ tế bào được xác định bằng buồng đếm hồng cầu (Neubauer improved của Đức), dưới kính hiển vi quang học (Hund Wetzlar với độ phóng đại 400 lần.

Mật độ tế bào được tính theo công thức:

      D (tb/ml) = A × 104  

      Trong đó: D là mật độ tế bào cần đếm (tb/ml)

                 A là tổng số tế bào đếm được trong ô E.

Vị trí buồng đếm

 

Hình 1: Buồng đếm hồng cầu

3.2.2. Lưu giữ giống

3.2.2.1.  Chuẩn bị giống

      Sau khi vi tảo được đưa từ môi trường thạch agar nuôi trong các bình thuỷ tinh tam giác 100 ml, nút kín bằng bông không thấm nước đã được sấy tiệt trùng để tránh vi khuẩn và động vật nguyên sinh xâm nhập.

      Các điều kiện nuôi: độ mặn 27‰, nhiệt độ 25oC, chu kỳ chiếu sáng liên tục nhưng cách xa dàn bóng đèn compac 20W từ 10- 20 cm.

      Chăm sóc: lắc hằng ngày 3-4 lần trong các thể tích nhỏ 100 ml và 250 ml. Khi mật độ vi tảo đạt yêu cầu thì tiến hành cấy chuyển sang thể tích 1 lít có sục khí liên tục. Tùy theo yêu cầu số lượng giống giữ mà tiến hành cấy chuyển tiếp sang các thể tích khác nhau. Trước khi lưu giữ, từng loài vi tảo được kiểm tra dưới kính hiển vi để đảm bảo yêu cầu chọn giống. Những mẫu không đạt yêu cầu để chọn cho quá trình giữ giống thì loại bỏ.

3.2.2.2.  Thực hiện lưu giữ giống 05 loài vi tảo

      Mẫu vi tảo giống được chọn lựa dựa vào đặc điểm của từng đối tượng và mật độ, sau đó vi tảo giống được chuyển vào dung dịch môi trường mới (độ mặn 27‰) trong các bình tam giác nhỏ (100 và 250 ml). Mật độ vi tảo dùng để đem nuôi cấy được cho tại bảng 1.   Đặt các bình chứa mẫu vi tảo đem cấy giống dưới ánh sáng với cường độ như khi nuôi giống trong các thể tích lớn

          Sử dụng agar tinh khiết có bổ sung môi trường dinh dưỡng theo điều chỉnh tỷ lệ N/P tùy theo từng loài. Tỷ lệ agar là 15g/ 1lít nước biển nuôi, bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng là 5 ml cho 1 L nước biển nuôi có độ mặn 27‰. Khuấy đều, đun sôi cho tan hết agar sau đó tiệt trùng bằng cách cho hấp ướt hoặc sấy khô trong các dụng cụ chuyên dùng đều được. Sau khi agar sử lý tiệt trùng xong thì để nguội bớt rồi bổ sung vitamin B1 và B12 trước khi đổ agar ra đĩa cấy.

- Dùng đĩa Petri: rót thạch đã tiệt trùng vào đĩa Petri sao cho độ dày của agar trong đĩa là 3 mm, chờ cho agar đông lại thì lật ngược đĩa lại để cho bề mặt agar được khô khi cấy vi tảo lên. Toàn bộ quá trình trên được thao tác trong tủ cấy vi sinh đảm bảo tiệt trùng. Sau khi để agar trong tủ cấy trong vòng 24 – 48 giờ thì tiến hành cấy vi tảo lên trên bề mặt thạch.

Bảng 1. Mật độ vi tảo dùng để cấy lưu giữ trên thạch agar

Chỉ tiêu

N.oculata

I. galbana

C. calcitrans

C.muelleri

T. pseudonana

Mật độ

25 – 28.106

12 – 14.106

8 – 10.106

6 – 8.106

6 – 8.106

3.2.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu đánh giá trong quá trình lưu giữ là: sự sống sót của giống, độ thuần, mật độ, trạng thái, màu sắc của tế bào vi tảo theo thời gian.

Chỉ tiêu đánh giá khả năng sinh trưởng của các loài vi tảo khi tái phát triển là mật độ cực đại và thời gian đạt mật độ cực đại.

Trên môi trường thạch cần xác định thời gian cần để các dòng vi tảo có màu đậm nhất và thời gian giữ được giống là bao lâu trong cả quá trình lưu giữ và tái phát triển.

3.2.3. Thử nghiệm nhân nuôi giống

3.2.3.1. Tảo Nannochloropsis oculata

          - Điều kiện thí nghiệm: Vi tảo được nuôi trong các bình nhựa 20L, mật độ vi tảo ban đầu thí nghiệm là 5 triệu tb/ml, nhiệt độ môi trường dao động 25 – 280 C, độ mặn 27‰, chiếu sáng theo chu kỳ 24/24h, sục khí liên tục.

      Mật độ vi tảo được kiểm tra 1 lần/ ngày vào lúc 8 h sáng từ ngày cấy thứ 2.

      Chỉ tiêu theo dõi: mật độ cực đại và thời gian đạt mật độ cực đại của N. oculata

3.2.3.2 Tảo Isochrysis galbana

      - Điều kiện thí nghiệm: Vi tảo được nuôi trong các bình nhựa 20L, mật độ vi tảo ban đầu thí nghiệm là 2 triệu tb/ml, nhiệt độ môi trường dao động 25 – 280 C, độ mặn 27‰, chiếu sáng theo chu kỳ 24/24h, sục khí liên tục.

      Mật độ vi tảo được kiểm tra 1 lần/ ngày vào lúc 8 h sáng từ ngày cấy thứ 2.

      Chỉ tiêu theo dõi: mật độ cực đại và thời gian đạt mật độ cực đại của I.galbana

3.2.3.3 Tảo Chaetoceros calcitrans

          - Điều kiện thí nghiệm: Vi tảo được nuôi trong các bình nhựa 20L, mật độ vi tảo ban đầu thí nghiệm là 1 triệu tb/ml, nhiệt độ môi trường dao động 25 – 280 C, độ mặn 27‰, chiếu sáng theo chu kỳ 24/24h, sục khí liên tục.

      Mật độ vi tảo được kiểm tra 1 lần/ ngày vào lúc 8 h sáng từ ngày cấy thứ 2.

          - Chỉ tiêu theo dõi: mật độ cực đại và thời gian đạt mật độ cực đại của vi tảo C. calcitrans

3.2.3.4 Tảo Chaetoceros muelleri

          - Điều kiện thí nghiệm: Vi tảo được nuôi trong các bình nhựa 20L, mật độ vi tảo ban đầu thí nghiệm là 0,6 triệu tb/ml, nhiệt độ môi trường dao động 25 – 280 C, độ mặn 27‰, chiếu sáng theo chu kỳ 24/24h, sục khí liên tục.

      Mật độ vi tảo được kiểm tra 1 lần/ ngày vào lúc 8 h sáng từ ngày cấy thứ 2.

          - Chỉ tiêu theo dõi: mật độ cực đại và thời gian đạt mật độ cực đại của vi tảo C. muelleri

3.2.3.5 Tảo Thalassiosira pseudonana

          - Điều kiện thí nghiệm: Vi tảo được nuôi trong các bình nhựa 20L, mật độ vi tảo ban đầu thí nghiệm là 1 triệu tb/ml, nhiệt độ môi trường dao động 25 – 280 C, độ mặn 27‰, chiếu sáng theo chu kỳ 24/24h, sục khí liên tục.

      Mật độ vi tảo được kiểm tra 1 lần/ ngày vào lúc 8 h sáng từ ngày cấy thứ 2.

          - Chỉ tiêu theo dõi: mật độ cực đại và thời gian đạt mật độ cực đại của vi tảo T. pseudonana

3.3. Xử lý số liệu

      Số liệu thu thập được từ các thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm Exel 2007.

Xác định tốc độ sinh trưởng của vi tảo nuôi bằng công thức:

μ = ln(D2/ D1) / t. Trong đó, D1 và D2 là mật độ vi tảo bắt đầu và sau khi kết thúc thí nghiệm, t (ngày) khoảng thời gian thực hiện thí nghiệm

 

  

PHẦN IV. KẾT QUẢ THỰC HIỆN VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả  thực hiện lưu giữ giống vi tảo

+ Phương pháp thực hiện lưu giữ trên thạch, ánh sáng yếu, nhiệt độ 20 – 25oC.

      Sử dụng agar tinh khiết có bổ sung môi trường dinh dưỡng. Tỷ lệ agar là 15g/ 1lít nước biển nuôi, bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng là 5 ml cho 1 L nước biển nuôi có độ mặn 28‰. Khuấy đều, đun sôi cho tan hết agar sau đó tiệt trùng bằng cách cho hấp ướt hoặc sấy khô trong các dụng cụ chuyên dùng đều được. Sau khi agar sử lý tiệt trùng xong thì để nguội bớt rồi bổ sung vitamin B1 và B12 trước khi đổ agar ra đĩa cấy.

- Dùng đĩa Petri: rót thạch đã tiệt trùng vào đĩa Petri sao cho độ dày của agar trong đĩa là 3 mm, chờ cho agar đông lại thì lật ngược đĩa lại để cho bề mặt agar được khô khi cấy vi tảo lên trên bề mặt. Toàn bộ quá trình trên được thao tác trong tủ cấy vi sinh đảm bảo tiệt trùng. Sau khi để agar trong tủ cấy trong vòng 24 – 48 giờ thì tiến hành cấy vi tảo lên trên bề mặt thạch.

- Thao tác cấy trên môi trường thạch: áp dụng giống quy trình kỹ thuật cấy vi khuẩn trên môi trường thạch.

- Điều kiện lưu giữ: để vi tảo sau khi cấy dưới ánh đèn Neon ở nhiệt độ 20 - 250C, khi tảo hình thành các tập đoàn mang màu sắc đặc trưng của loài thì đem lưu giữ. Giống N.oculata ddwwocj đặt trong tủ bảo quản 8 - 100C, ánh sáng yếu. Các giống còn lại được đặt trong phòng có điều hòa nhiệt độ đảm bảo nhiệt độ duy trì 20 – 25oC và có ánh sáng yếu.

Các chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu đánh giá trong quá trình lưu giữ là: sự sống sót của giống, độ thuần, mật độ, trạng thái, màu sắc của tế bào vi tảo theo thời gian.

Khoảng thời gian tối ưu: là khoảng thời gian mà tảo đưa vào lưu giữ đã thích nghi với điều kiện nuôi mới cho đến khi phát triển đến giai đoạn cực đại (các đường cấy có mầu đậm đặc trưng của giống tảo lưu giữ). Trên môi trường thạch cần xác định thời gian cần để các dòng vi tảo có màu đậm nhất và thời gian giữ được giống là bao lâu trong cả quá trình lưu giữ và tái phát triển. Qua khoảng thời gian tối ưu vi tảo đều không thích hợp để sử dụng cho cấy chuyển giống vì mẫu tảo không đảm bảo sức sống, bị nhiễm tạp hoặc bị chết.

4.1.1.  Lưu giữ N. oculata

      Cấy N. oculata bằng dịch lỏng giống trên thạch giống tương tự như thao tác cấy vi sinh trong điều kiện tủ cấy chuyên dụng. Quá trình cấy giống lưu giữ cần  đảm bảo các mẫu cấy đều sống sót, không bị nhiễm tạp (nấm, vi khuẩn… ). Sau khi cấy, các đĩa thạch (ống nghiệm) được lưu giữ trong điều kiện nhiệt độ 20 - 25˚C, có chiếu sáng nhẹ. Kết quả thực hiện cho thấy hầu hết các mẫu N. oculata lưu giữ đều giữ được giống tảo. Các đường cấy trên mặt thạch đều có sự phát triển của tảo và có mầu sắc đặc trưng của loài (hình 2)

 

Hình 2. Giống tảo N.oculata lưu giữ trên môi trường thạch agar.

Qua đánh giá mầu sắc, chất lượng vi tảo lưu giữ cho thấy các N.oculata có khoảng thời gian lưu giữ tối ưu trong khoảng 10 ngày đến 6 tháng. Việc giữ giống tới thời điểm này cần phải thực hiện cấy chuyển giống sang môi trường thạch mới để đảm bảo sức sống và sự thuần chủng của giống lưu giữ.

4.1.2.  Lưu giữ  I. galbana

      Các điều kiện và thao tác cũng tương tự như thực hiện lưu giữ N.oculata. Kết quả lưu giữ I. galbana cho thấy hầu hết các mẫu tảo lưu giữ đều giữ được giống tảo. Tảo trên các đĩa thạch có mầu sắc đặc trưng của loài. Kiếm tra mẫu dưới kính hiển vi thấy các tế bào khỏe mạnh, không bị nhiễm tạp.Theo thời gian lưu giữ, các đường cấy tảo ngày càng trở nên đậm mầu hơn (hình 3).

Hình 3: Mẫu I. galbana trên agar

Qua đánh giá mầu sác, chất lượng vi tảo lưu giữ cho thấy I. galbana  có khoảng thời gian lưu giữ tối ưu 01 –0 4 tháng. Việc giữ giống tới thời điểm này cần phải thực hiện cấy chuyển giống sang môi trường thạch mới để đảm bảo sức sống và sự thuần chủng của giống lưu giữ.

4.1.3.  Lưu giữ C. calcitrans

      Cấy vi tảo C. calcitrans đã chọn lọc trên môi trường lỏng trong pha sinh trưởng lên trên agar có bổ sung môi trường. Sau đó quan sát sự phát triển của các cụm tế bào tảo ở các đường cấy trên bề mặt agar, để tiến hành quá trình cấy chuyển giống. Lựa chọn ra mẫu vi tảo có sự phát triển tốt nhất và có thời gian lưu giữ lâu nhất mà vẫn đảm bảo được sức sống và độ thuần chủng của tảo lưu giữ. Kết quả lưu giữ C. calcitrans trên môi trường thạch được thể hiện qua hình 4.

Hình 4. C. calcitrans lưu giữ trên thạch agar

Qua đánh giá mầu sác, chất lượng vi tảo lưu giữ cho thấy C. calcitrans có khoảng thời gian lưu giữ tối ưu 01 –0 3 tháng. Việc giữ giống tới thời điểm này cần phải thực hiện cấy chuyển giống sang môi trường thạch mới để đảm bảo sức sống và sự thuần chủng của giống lưu giữ.

4.1.4. Lưu giữ C. muelleri

          Các điều kiện và thao tác cũng tương tự như thực hiện lưu giữ C. calcitrans . Kết quả lưu giữ C.muelleri  cho thấy hầu hết các mẫu tảo lưu giữ đều giữ được giống tảo. Tảo trên các đĩa thạch có mầu sắc đặc trưng của loài. Kiếm tra mẫu dưới kính hiển vi thấy các tế bào khỏe mạnh, không bị nhiễm tạp.Theo thời gian lưu giữ, các đường cấy tảo ngày càng trở nên đậm mầu hơn. Có thể thấy màu sắc của giống C. muelleri trên bề mặt dụng cụ giữ giống đặc trưng cho vi tảo nâu, màu rất sáng và khỏe  (hình 5).

Hình 5. Mẫu C. muelleri cấy trên thạch agar

Qua đánh giá mầu sác, chất lượng vi tảo lưu giữ cho thấy C. muelleri có thời gian lưu giữ tối ưu trong khoảng 01 đến 04 tháng. Việc giữ giống tới thời điểm này cần phải thực hiện cấy chuyển giống sang môi trường thạch mới để đảm bảo sức sống và sự thuần chủng của giống lưu giữ.

4.1.5.  Lưu giữ T. pseudonana

      Cũng giống như cách lưu giữ giống của các loài vi tảo nâu thì T. pseudonana được lưu giữ trên thạch cũng có mầu sắc đặc trưng của loài. Tảo lưu giữ phát triển mạnh, tạo mầu sắc đặc trưng trên những đường cấy bề mặt đĩa thạch. Tới thời gian hiện tại, giống vẫn còn sống sót và được duy trì trạng thái sinh trưởng tốt nhất trong phòng thí nghiệm. Các mẫu lưu giữ duy trì được giống tảo khỏe mạnh và đảm bảo độ thuần chủng (hình 6)

Hình 6: Mẫu T. pseudonana lưu giữ trên môi trường thạch agar

Qua đánh giá mầu sắc, chất lượng vi tảo lưu giữ cho thấy T. pseudonana có thời gian lưu giữ tối ưu trong khoảng 01 đến 04 tháng. Để cấy chuyển giống phải thực hiện trong thời gian này để cấy chuyển giống sang môi trường thạch mới mà vẫn đảm bảo sức sống và sự thuần chủng của giống lưu giữ.

4.2. Đánh giá chất lượng vi tảo lưu giữ qua việc nhân nuôi giống trở lại

Hình 7. Nhân nuôi giống lưu giữ

 

4.2.1. Nannochloropsis oculata

Các mẫu giống N. oculata được lấy trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu được đem nhân nuôi trở lại để đánh giá chất lượng tảo giống, sức sống và độ thuần chủng của tảo lưu giữ. Kết quả cho thấy tảo phát triển khỏe mạnh, mầu sặc đặc trưng. Nuôi đến giai đoạn mật độ cực đại dịch tảo có mầu đậm đặc, các tế bào không bị vón cục, không lắng đáy và không bị nhiễm tạp. Kết quả đánh giá sức sống của N.oculata lưu giữ được cho ở bảng 2.

Bảng 2. Kết quả nhân nuôi giống N. oculata lưu giữ

Chỉ tiêu

Mẫu 01

Mẫu 02

Mẫu 03

Mẫu 04

Mẫu 05

Mẫu 06

MĐBĐ (tb/ml)

5.106

5.106

5.106

5.106

5.106

5.106

MĐCĐ (tb)

(tb/ml)

62.106

61.106

62,5.106

60.106

61.106

60.106

T (ngày)

14 - 16

14 - 15

14 - 15

13 - 14

14 - 15

13 - 15

µ (TĐST)

0,16 – 0,18

0,17 – 0,18

0,17 – 0,18

0,18 -0,19

0,17 – 0,18

0,17 – 0,19

Ghi chú:

Mẫu 01, mẫu 06: mẫu lưu giữ được 01 tháng, mẫu lưu giữ được 06 tháng

MĐCD: Mật độ cực đại; MĐBĐ: mật độ ban đầu (mật độ thả giống).

T: thời gian nuôi (ngày)

Qua bảng trên ta thấy, trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu các mẫu giống lấy ra đem nhân nuôi trở lại đều đảm bảo sức sống tốt. Tốc độ sinh trưởng, thời gian đạt mật độ cực đại và mật độ cực đại đạt được không có sự sai khác. Do vậy đối với N.oculata trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu từ 01 – 06 tháng việc lấy giống tảo ra đêm nhân nuôi trở lại luôn đảm bảo tảo có sức sống tốt. Với mật độ nuôi cấy ban đầu là 5.106tb/ml sau 13 – 16 ngày nuôi tảo đạt mật độ cực đại 60 – 62.106tb/ml và tốc độ sinh trưởng đạt 0,16 – 0,19.

4.2.2. Isochrysis galbana

Các mẫu giống I. galbana được lấy trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu được đem nhân nuôi trở lại để đánh giá chất lượng tảo giống, sức sống và độ thuần chủng của tảo lưu giữ. Kết quả cho thấy tảo phát triển khỏe mạnh, mầu sặc đặc trưng.

Bảng 3: Kết quả nhân nuôi giống I.galbana lưu giữ

Chỉ tiêu

Mẫu 01

Mẫu 02

Mẫu 03

Mẫu 04

MĐBĐ (tb/ml)

2.106

2.106

2.106

2.106

MĐCĐ (tb)

(tb/ml)

22.106

23.106

24.106

22,5.106

T (ngày)

10 - 11

10 - 11

10 - 12

10 - 11

µ (TĐST)

0,29 – 0,31

0,29 – 0,31

0,26 – 0,32

0,28 -0,31

Ghi chú:

Mẫu 01, mẫu 04: mẫu lưu giữ được 01 tháng, mẫu lưu giữ được 04 tháng

MĐCD: Mật độ cực đại; MĐBĐ: mật độ ban đầu (mật độ thả giống)

T: thời gian nuôi (ngày)

Qua bảng trên ta thấy, trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu các mẫu giống lấy ra đem nhân nuôi trở lại đều đảm bảo sức sống tốt. Tốc độ sinh trưởng, thời gian đạt mật độ cực đại và mật độ cực đại đạt được không có sự sai khác.

Do vậy đối với I. galbana trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu từ 01 – 04 tháng việc lấy giống tảo ra đêm nhân nuôi trở lại luôn đảm bảo tảo có sức sống tốt.

Với mật độ nuôi cấy ban đầu là 2.106tb/ml sau 10 – 12 ngày nuôi tảo đạt mật độ cực đại 22 – 24.106tb/ml và tốc độ sinh trưởng đạt 0,26 – 0,32.

4.2.3. Chaetoceros calcitrans

Kết quả đánh giá chất lượng giống C.calcitrans lưu giữ năm 2021 được cho tại bảng 4.

Bảng 4: Kết quả nhân nuôi giống C. calcitrans lưu giữ

Chỉ tiêu

Mẫu 01

Mẫu 02

Mẫu 03

MĐBĐ (tb/ml)

1.106

1.106

1.106

MĐCĐ (tb)

(tb/ml)

20.106

19.106

17.106

T (ngày)

10 - 11

9 - 11

10 - 11

µ (TĐST)

0,27 – 0,3

0,27 – 0,33

0,26 – 0,28

Ghi chú:

Mẫu 01, mẫu 03: mẫu lưu giữ được 01 tháng, mẫu lưu giữ được 03 tháng

MĐCD: Mật độ cực đại; MĐBĐ: mật độ ban đầu (mật độ thả giống)

T: thời gian nuôi (ngày)

Các mẫu giống C. calcitrans được lấy trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu (01 – 03 tháng) được đem nhân nuôi trở lại để đánh giá chất lượng tảo giống, sức sống và độ thuần chủng của tảo lưu giữ. Kết quả trên cho thấy các mẫu giống lấy ra đem nhân nuôi trở lại đều đảm bảo sức sống tốt. Tốc độ sinh trưởng, thời gian đạt mật độ cực đại và mật độ cực đại đạt được không có sự sai khác.

Do vậy đối với C. calcitrans trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu từ 01 – 03 tháng việc lấy giống tảo ra đêm nhân nuôi trở lại luôn đảm bảo tảo có sức sống tốt. Với mật độ nuôi cấy ban đầu là 1.106tb/ml sau 9 – 11 ngày nuôi tảo đạt mật độ cực đại 17 – 20.106tb/ml và tốc độ sinh trưởng đạt 0,26 – 0,33.

4.2.4. Chaetoceros muelleri

Các mẫu giống C.muelleri được lấy trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu được đem nhân nuôi trở lại để đánh giá chất lượng tảo giống, sức sống và độ thuần chủng của tảo lưu giữ. Kết quả cho thấy tảo phát triển khỏe mạnh, mầu sặc đặc trưng. Nuôi đến giai đoạn mật độ cực đại dịch tảo có mầu đậm đặc, các tế bào không bị vón cục, không lắng đáy và không bị nhiễm tạp.

Kết quả đánh giá sức sống của C.muelleri lưu giữ được cho ở bảng 5.

Bảng 5. Kết quả nhân nuôi giống C. muelleri lưu giữ

Chỉ tiêu

Mẫu 01

Mẫu 02

Mẫu 03

Mẫu 04

MĐBĐ (tb/ml)

0,6.106

0,6.106

0,6.106

0,6.106

MĐCĐ (tb)

(tb/ml)

12.106

13.106

12,5.106

13,5.106

T (ngày)

8 - 9

8 - 10

9 - 10

9 - 10

µ (TĐST)

0,33 – 0,37

0,31 – 0,38

0,33 – 0,34

0,31 -0,35

Ghi chú:

Mẫu 01, mẫu 04: mẫu lưu giữ được 01 tháng, mẫu lưu giữ được 04 tháng

MĐCD: Mật độ cực đại; MĐBĐ: mật độ ban đầu (mật độ thả giống)

T: thời gian nuôi (ngày)

Qua bảng trên ta thấy, trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu các mẫu giống lấy ra đem nhân nuôi trở lại đều đảm bảo sức sống tốt. Tốc độ sinh trưởng, thời gian đạt mật độ cực đại và mật độ cực đại đạt được không có sự sai khác. Do vậy đối với C. muelleri  trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu từ 01 – 04 tháng việc lấy giống tảo ra đêm nhân nuôi trở lại luôn đảm bảo tảo sống có sức sống tốt. Với mật độ nuôi cấy ban đầu là 0,6.106tb/ml sau 8 – 10 ngày nuôi tảo đạt mật độ cực đại 12 – 13,5.106tb/ml và tốc độ sinh trưởng đạt 0,31 – 0,37.

 4.2.5 Thalassiosira pseudonana

Đánh giá chất lượng giống T. pseudonana năm 2021 được cho tại bảng 6.

Bảng 6. Kết quả nhân nuôi giống T. pseudonana lưu giữ

Chỉ tiêu

Mẫu 01

Mẫu 02

Mẫu 03

Mẫu 04

MĐBĐ (tb/ml)

1.106

1.106

1.106

1.106

MĐCĐ (tb)

(tb/ml)

12.106

14.106

12,5.106

13,5.106

T (ngày)

7 - 9

7 - 8

7 - 8

8 - 9

µ (TĐST)

0,28 – 0,35

0,33 – 0,38

0,32 – 0,36

0,29 -0,33

Các mẫu giống T. pseudonana được lấy trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu (01 – 04 tháng) được đem nhân nuôi trở lại để đánh giá chất lượng tảo giống, sức sống và độ thuần chủng của tảo lưu giữ. Kết quả trên cho thấy các mẫu giống lấy ra đem nhân nuôi trở lại đều đảm bảo sức sống tốt. Tốc độ sinh trưởng, thời gian đạt mật độ cực đại và mật độ cực đại đạt được không có sự sai khác. Do vậy đối với T. pseudonana trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu từ 01 – 04 tháng việc lấy giống tảo ra đêm nhân nuôi trở lại luôn đảm bảo tảo có sức sống tốt. Với mật độ nuôi cấy ban đầu là 1.106tb/ml sau 7 – 9 ngày nuôi tảo đạt mật độ cực đại 12 – 14.106tb/ml và tốc độ sinh trưởng đạt 0,28 – 0,38.

 

 

 

 


 

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1. Kết luận

5.1.1 Lưu giữ giống

          Đã lưu giữ và duy trì được chất lượng giống của 05 loài vi tảo theo yêu cầu. Nguồn giống lưu giữ khỏe mạnh, đảm bảo độ thuần chủng và chủ động được nguồn giống cung cấp cho các nhiệm vụ khác.

5.1.2. Kết quả đánh giá tốc độ sinh trưởng của tảo lưu giữ.

Trong khoảng thời gian lưu giữ tối ưu, hầu hết các giống tảo đưa nhân nuôi trở lại đều phát triển bình thường và không có sự sai khác nhiều về tốc độ sinh trưởng và mật độ cực đại đạt được trong khoảng thời gian này.

Với mật độ ban đầu là 5.106tb/ml, ở điều kiện nuôi 25 - 280C sau 13 – 16 ngày tảo nuôi đạt mật độ cực đại 60 – 62.106tb/ml, tốc độ sinh trưởng µ đạt 0,16 – 0,19.

Với mật độ ban đầu 2.106tb/ml, ở diều kiện nuôi nuôi 25 - 280C sau 10 – 12  ngày tảo nuôi đạt mật độ cực đại 22 – 24.106tb/ml, tốc độ sinh trưởng (µ) đạt 0,28 – 0,32

Với mật độ ban đầu 1.106tb/ml, ở diều kiện nuôi nuôi 25 - 280C sau 9 – 11  ngày tảo nuôi đạt mật độ cực đại  12  -13.106tb/ml, tốc độ sinh trưởng (µ) đạt  0,26 – 0,33

Với mật độ ban đầu 0,6 .106tb/ml, ở diều kiện nuôi nuôi 25 - 280C sau 8 – 10   ngày tảo nuôi đạt mật độ cực đại  12  -13,5 .106tb/ml, tốc độ sinh trưởng (µ) đạt  0,31 – 0,38

Với mật độ ban đầu 1 .106tb/ml, ở diều kiện nuôi nuôi 25 - 280C sau 7 – 9   ngày tảo nuôi đạt mật độ cực đại  12  -14 .106tb/ml, tốc độ sinh trưởng (µ) đạt  0,28 – 0,38

 

 

 

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài Liệu Tiếng Việt

1. Phạm Thị Lam Hồng (1999), Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn, ánh sáng và tỷ lệ thu hoạch lên một số đặc điểm sinh học, thành phần sinh hóa của hai loài vi tảo N. oculata và C. muelleri trong điều kiện thí nghiệm, Luận văn thạc sỹ. Đại học Thủy sản Nha Trang, Khánh hòa.

2. Nguyễn Thị Hương (2001), Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo C. calcitrans Paulsen, 1905 nhập nội, Luận văn thạc sỹ. Đại học Thủy sản Nha Trang.

3. Đặng Đình Kim, Đặng Phước Hiền (1999), Công nghệ sinh học vi tảo, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

4. Đặng Đình Kim (2002), Kỹ thuật nhân giống và nuôi sinh khối sinh vật phù du, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

5. Đỗ Văn Khương và Lê Viễn Chí (1991), “Kết quả nghiên cứu kỹ thuật giữ giống dài hạn tảo silic”. Các công trình nghiên cứu KHKT thủy sản 1986 – 1990. Vụ quản lý KHKT - Tạp chí Thủy sản. Bộ Thủy sản. Hà Nội. tr 168 – 177.

6. Đặng Thị Sy, Tảo học (2005), NXB Đại học Quốc gia Hà Nội

7. Lê Viễn Trí (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học công nghệ nuôi tảo silic Skeletonema costatum (Greville) Cleve làm thức ăn cho ấu trùng tôm biển, Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học. Viện nghiên cứu Hải sản, Hải Phòng.

Tài Liệu Tiếng Anh

8. A.I.Compa-Cordova a,*, A.Luna-González b, F. Ascencioa, E.Cortés-Jacintoa, C.J.Casceres-Martínerc (2006), “Effects of chloramphenicol, erythromycin, and furazolidone on growth of Isochrysis galbana and Chaetoceros gracilis”, Aquaculture, (260), PP145-150,

9. Baek SH, Jung SW, Shin K (2011). Effects of temperature and salinity on growth of Thalassiosira pseudonana (Bacillariophyceae) isolated from ballast water. Journal of Freshwater Ecology, 26, 547-552.

10. E. Molina Grima, J.A.SánchezPérez*, F. García Camacho, F.G.Acién Fer nansdez, D.Losper Alonso, C.I.Segura del Castillo (1994), “ Preservation of the marine microalga, Isochrysis galbana: influence on the fatty acid profile”, Aquaculture, (123), PP377 – 385,

11. Frank H. Hoff & Terry W. Snell (1999), Plankton Culture Manual.  Hanbook of Cambridge University Press (1973),

12. Patrick Lavens and Patrick Sorgeloos (1996), Manual of the production and use of live food for aquaculture, Laboratory of Aquaculture and Artemia Reference Centre – University of Ghent, Belgium.

13. W.Jeftrey, M.R.Brown và C.D.Garl and Microalgea for Mariculture,

 

Nguồn tin: http://gca.ria1.org/
Lượt xem: 98

Các tin khác

ĐƠN VỊ CHỦ TRÌ

anh

CÁC ĐỐI TÁC

anh anh anh anh anh

LIÊN KẾT WEBSITE