1. Phương pháp tách chiết DNA

Nguyên tắc: có thể tách chiết DNA từ các nguyên liệu khác nhau như máu, mô cơ, da, vảy và các loại mô khác. Có nhiều phương pháp tách chiết khác nhau. Tuy vậy, tách chiết DNA có một nguyên tác chung là:

• Tách tế bào có nhân ra khỏi vật mang
• Phá vỡ tế bào, màng và phân hủy protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân
• Tách Dna ra khỏi đệm và bảo quản DNA ở 4⁰C.

Các bước tiến hành:

Tùy theo các nguyên liệu khác nhau mà ta có thể áp dụng một số bước tiến hành khác nhau:

1.1. Tách chiết DNA từ mô

Bước 1: Cắt mô thành từng miếng nhỏ. Nghiền mô trong nitơ lỏng để thành bột mịn. Cho mẫu vào óng nghiệm chờ nitơ bay hết. Cho khoảng 100mg mẫu vào óng eppendorf loại 1,5ml.

Bước 2: Thêm 500µl đệm STE (0,1M NaCl, 0,05M Tris-HCl (pH 7,5), 0,001m EDTA). Hòa trộn nhẹ nhàng. Bổ sung 12 µl protease K (nồng độ 10mg/ml) và 37 µl SDS 10%. Trộn đều hỗn hợp, ủ ở 55⁰C trong 2 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ.

Bước 3: Thêm 1 lượng dung dịch PCI (phenol: chloroform: Isoamyl alcohol với tỷ lệ 25:24:1) bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 9000 vòng/5 phút.

Bước 4: Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf sạch. Lặp lại bước 3 và 4 một lần nữa.

Bước 5: Thêm một lượng dung dịch CI (Chloroform: Isoamyl alcohol với tỷ lệ 24:1) bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 9000 vòng/5 phút. Chuyển phần dịch nổi sang ống eppendorf sạch.

Bước 6: Thêm một lượng Sodium acetate 3M (NaOAc) bằng 1/10 lượng mẫu và một lượng cồn ethylic 95% bằng 2,5 lần lượng mẫu ở -20⁰C ít nhất trong 2 giờ, hoặc qua đêm. Ly tâm 9000 vòng/10 phút.

Bước 7: Rửa sạch bằng cồn ethylich 70%. Hút sạch ethylic.

Bước 8: Hòa tan kết tủa bằng 500 µl dung dịch TE 1X, bảo quản ở 4⁰C.

1.2. Tách chiết DNA từ máu bằng chelex

Bước 1: Lấy 100 µl máu tươi, hoặc 1 miếng giấy thấm, hoặc vải đã thấm máu kích thước 0,5 x 0,5cm vào ống eppendorf.

Bước 2: thêm 1ml đệm chiết PBS (137mM NaCl; 2,7mM KCl; 10mM Na₂HPO₄; 2mM KH₂PO₄) lắc đều, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Ly tâm 14000 vòng/5 phút. Thu kết tủa.

Lặp lại bước 2 khoảng 2-3 lần.

Bước 3: Thêm 150 µl Chelex, bảo quản ở nhiệt độ 4⁰C đến -20⁰C.

1.3. Tách chiết DNA từ máu nhờ muối

Bước 1: lấy khoảng 0,1ml máu tĩnh mạch cho vào eppendorf có chứa 25 µl EDTA 0,4M, lắc đều.

Bước 2: Thêm vào eppendorf đệm phá hồng cầu (1mM NH₄HCO₃, 115mM NH₄Cl). Ly tâm 500 vòng/phút. Thu kết tủa, loại bỏ phần dịch nổi phía trên.

Bước 3: Thêm vào ống 200 µl đệm phá bạch cầu (100mM Tris-HCl pH 7,6; 40mM EDTA; 50mM NaCl; 0,2% SDS; 0,05% Sodium azide). Lắc đều.

Bước 4: Thêm 20 µl protein K (10mg/ml). Ủ ở 50⁰C trong 2 giờ.

Bước 5: Thêm 80 µl NaCl bão hòa 6M. Lắc mạnh bằng vortex. Ly tâm 5000 vòng/ 10 phút, thu dịch nổi phía trên cho vào eppendorf sạch.

Bước 6: kết tủa DNA bằng cồn Ethanol tuyệt đối

Bước 7: Hòa tan kết tủa bằng dung dịch TE 1X. Bảo quản ở 4⁰C đến -20⁰C.

2. Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN

         Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn ADN đích một cách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân gene PCR.

3. Kỹ thuật nhân gene PCR  (Polymerase Chain Reaction)

         Việc nhân ADN cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích nguồn ADN khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu. Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi ADN sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật.

4. Nguyên tắc cơ bản của PCR

4.1. Khái quát chung:

PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.

Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được thiết kế thì chúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trường hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định typ vi sinh vật.

Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzym ADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94^oC và như vậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này đã được cải thiện do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus ) chịu nhiệt. Enzym này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc độ xúc tác cho phản ứng của enzym này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại 755^oC. Hoạt tính enzym giảm một nửa khi xử lý tại 92.5^oC trong 230 phút hoặc 40 phút tại 95^oC. Như vậy khi dùng enzym này thì không cần bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng.

 4.2. Các thông số kỹ thuật:

            Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi khuôn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo ra sản phẩm nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bị ADN theo phương  pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm giảm Mg⁺⁺ (do EDTA hoặc tạo thành muối Mg₃(PO4)₂ khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có thể nhân được đoạn gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế thường dùng để nhân các đoạn có kích thước ngắn hơn (<2 Kb). Có thể tham khảo các thông số thành phần phản ứng PCR trong bảng dưới đây.

Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR.

 

Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện tượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc chọn mồi nhờ sự trợ giúp của các chương trình máy tính.

Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu, điều này thường hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin. Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành phần như nhiệt độ, nồng độ Mg⁺⁺ và enzym có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt của nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng.

Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanh chóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này yêu cầu sản phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo cách này trình tự có thể được thực hiện như sau: Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa với ethanol. Kết tủa được hoà với đệm thích hợp và sau đó được xử lý với enzym cắt hạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thường trên gel agarose, trong một số trường hợp có thể trên gel polyacylamid để thu được độ phân giải cao hơn. Chú ý rằng thông thường hoạt tính enzym giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy có thể ước lượng 50% hiệu quả khuyếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng.

5. Giải trình tự ADN

Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gene bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau.

5.1. Nguyên tắc:

Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả.

5.2. Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger:

Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân ADN từ sợi khuôn khi có đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay T7-ADN polymerase và 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng. Trình tự của ADN được xác định trên gel. Đầu tiên phương pháp này được xây dựng cho xác định trình tự sợi ADN đơn tạo ra bằng cách tách dòng ADN vào vectơ thực khuẩn thể M13 (Sanger và cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xác định trình tự sợi đôi ADN đã được Chen, William (1986) mô tả khi tách dòng ADN vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trình tự ADN cho nghiên cứu phân loại và xác định typ vi sinh vật thay cho phương pháp hóa học.

Một số lợi thế của phương pháp này ở chỗ: Phương pháp này đơn giản và không tốn nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên cứu phân loại và xác định typ thì các gene nghiên cứu có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùng chung mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế của phương pháp này ở chỗ các đoạn ADN cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tự ADN. Tuy nhiên cho đến nay người ta đã cải tiến phương pháp này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR.

Có hai phương pháp: Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang).

5.2.1. Phương pháp truyền thống

Các bước chính cho giải trình tự ADN như sau:

         Chuẩn bị ADN khuôn

         Bắt cặp ADN khuôn và mồi

         Tiến hành phản ứng giải trình tự ADN

         Tách sản phẩm trên gel polyacrylamid biến tính với urea.

         Đọc kết quả.

     Tuy nhiên cần chú ý một số điểm sau:

1.     Chuẩn bị ADN khuôn.

2.     Điều kiện bắt cặp mồi.

3.     Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN.

4.     Tách sản phẩm trên acrylamid gel.

5.     Đọc kết quả.

* Một số điểm cần được chi tiết thêm cho mỗi bước như sau:

- Chuẩn bị ADN khuôn:

Sợi khuôn cần được hiểu là việc giải trình tự được thực hiện với sợi đơn (vectơ M13) hay sợi đôi ADN. Việc đọc trình tự theo sợi đơn thường cho kết quả là kích thước đoạn gene đọc dài và độ chính xác cao. Ngày nay người ta thường đọc sợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễ dàng hơn, ngoài ra khi sử dụng hai phản ứng với hai mồi tương thích thì quá trình đọc lại chính xác hơn. Đó là ưu thế của cách đọc sợi đôi ADN. Do vậy, rất cần đọc kết quả từ cả hai sợi ADN. Hiện nay phương pháp đọc trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR đang ngày càng trở lên phổ biến.

- Chuẩn bị sợi ADN mồi cho bước bắt cặp vào sợi khuôn:

Người ta có thể dùng các đoạn ADN mồi tiêu chuẩn đặc hiệu cho trình tự ADN của vectơ gần sát với sợi khuôn hay primer đặc hiệu của sợi khuôn mà nó sẽ bắt cặp vào. Tiện ích của việc dùng mồi chuẩn ở chỗ mọi điều kiện đã được lựa chọn cho sợi khuôn và mồi được dùng lặp đi lặp lại nhiều lần cho các sợi khuôn khác nhau. Hạn chế của loại mồi này ở chỗ chỉ đọc được một đoạn ngắn của gene (300 – 500 bps) trong trường hợp phải đọc các gene có kích thước lớn cần phải tiến hành subclone để đọc tiếp. Điều này có thể thực hiện bằng cách tạo ra các đoạn ADN ngẫu nhiên từ toàn bộ gene sau đó lại gắn vào vectơ để đọc cho hết trình tự của gene.

5.2.2. Phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động

Phương pháp này sử dụng mồi được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với trình tự của gene. Theo cách này, lần lượt các đoạn được đọc mà không cần thao tác subclone. Tuy nhiên theo cách đoạn mồi được thiết kế để đọc gene như vậy thì điều kiện cho từng phản ứng giải trình tự ADN với các mồi khác nhau sẽ không được tối ưu. Tuy vậy, hiện nay việc tổng hợp mồi đã trở nên dễ dàng và phổ biến với giá thành thấp, hơn thế nữa với sự trợ giúp của tin học thì bước thiết kế mồi đã được tối ưu hoá. Vì vậy phương pháp này ngày càng trở lên thông dụng hơn. Sau khi mồi đã được thiết kế thì việc tiếp theo là chọn cách đánh dấu vào mồi hay vào đoạn ADN sẽ được tổng hợp. Ưu thế của việc đánh dấu ngay tại đầu 5’ của mồi ở chỗ các băng ADN thường có cùng một cường độ tín hiệu. Thông thường với phương pháp đọc trình tự thủ công thì P³² thường được dùng. Ưu thế của nó là mang gốc photphat cao năng bêta mạnh, do đó chỉ cần trong thời gian ngắn là thu được tín hiệu. Hạn chế của phương pháp này là do mang năng lượng cao nên khó phân biệt giữa các băng khác nhau so với dùng S³⁵. Hiện nay để giải quyết vấn đề này người ta dùng P³³tuy giá thành cao nhưng cho kết quả tốt hơn.

6. Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN

6.1. Phương pháp 1: Tinh sạch Plasmid cho giải trình tự ADN.

Hiện nay có nhiều kỹ thuật tinh sạch plasmid khác nhau, phương pháp được trình bày dưới đây là phương pháp thu được plasmid có độ tinh sạch cao, có thể dùng cho cả giải trình tự ADN thủ công và tự động hóa. Quá trình này là cải tiến phương pháp sử dụng dịch kiềm làm tan tế bào, sau đó sử dụng sắc ký qua cột trao đổi ion. Cũng như các sản phẩm được lưu hành trên thị trường của các công ty, hạn chế lớn nhất của phương pháp này là giá thành của nhựa trao đổi ion tương đối đắt. Thực tế có rất nhiều công việc phải giải trình tự một cách thủ công và các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra nhiều phương pháp tinh sạch khác nhau để thu nhận ADN đạt độ sạch cần thiết, thậm chí có thể dùng cho giải trình tự ADN tự động. Tuy vậy, nhiều người vẫn thích sử dụng cột trao đổi ion, kết quả có thể đọc được tới 600 bps hoặc nhiều hơn nữa.

Quá trình tinh sạch như sau:

Nuôi cấy vi khuẩn mang plasmid trên môi trường chọn lọc với kháng sinh tương ứng (khoảng 3 ml).

1, Phân 3 ml môi trường LB chứa 100 mg/ml apicilin trong ống nghiệm vô trùng (12X100 nm có nút).

2, Vô trùng đầu que cấy trên lửa và làm nguội trên mặt đĩa thạch.

3, Lấy sinh khối từ một khuẩn lạc và đưa vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy trên.

4, Nuôi cấy vi khuẩn 37­^oC qua đêm có lắc vừa phải.

Chuẩn bị ADN dùng cột Qiagene:

Các cột Qiagene được chuẩn bị dễ dàng và nhanh để tinh sạch ADN không cần dùng gradient CsCl. ADN được chuẩn bị theo phương pháp này đạt kết quả rất tốt cho việc biến nạp và giải trình tự gene.

Có hai chú ý quan trọng khi dùng cột Quiagene là: (1) Không sử dụng quá nhiều mẫu lên cột, điều này rất quan trọng vì nếu dùng thể tích quá nhiều kết quả là sẽ có nhiều protein ảnh hưởng đến khả năng bám cột của ADN. Với cách này có thể nhận được lượng ADN có chất lượng cao hơn từ thể tích ít hơn. Nếu như lượng ADN thu được ít từ lần thử đầu tiên thì cần thực hiện đúng theo chỉ dẫn để lần thử thứ 2 với thể tích lớn hơn. Khi có một loạt thể tích mẫu được Quiagene khuyến cáo lên cột để đạt được hiệu suất tinh sạch cao nhất thì nên dùng lượng dịch lên cột có thể tích nhỏ nhất. (2) Đảm bảo cột phải được rửa hai lần trước khi giải phóng ADN ra khỏi cột, điều này cũng rất có ý nghĩa vì việc rửa như vậy sẽ loại trừ được protein và các thành phần tạp nhiễm khác.

Các bước dùng cột trao đổi Qiagene (tài liệu hướng dẫn sử dụng Quiagene):

1.     Ly tâm khoảng 1,3 ml dịch vi khuẩn mang plasmid. Làm tan với 0.3 ml đệm P1 có RNase, chuyển sang tube mới.

2.     Thêm vào 0.3 ml đệm P2 và trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút (không nên để lâu hơn).

3.     Thêm vào 0.3 ml đệm P3 trộn đều ngay nhưng phải nhẹ nhàng, ly tâm ở 4^oC trong 30 phút với tốc độ 15000 v/phút. Thu lấy phần trên tủa.

4.     Ly tâm lại như bước 3 một lần nữa để loại các phần cặn nếu có.

5.     Cân bằng đệm cho cột Qiagene-tip 20 với 1ml QBT và để cho đệm chảy hết tự do.

6.     Đưa phần dịch thu được ở bước 4 lên cột và để tự chảy qua cột.

7.     Rửa cột 2 lần, mỗi lần 1 ml đệm QC.

8.     Thu ADN với 0.8 ml đệm QF.

9.     Kết tủa ADN với 0.7 thể tích isopropanol (trước đó đưa về nhiệt độ phòng). Ly tâm 15000 v/phút tại 4^oC.

10.       Rửa ADN thu được với ethanol 70%, để khô 5 phút và hoà tan lại trong thể tích đệm thích hợp (25ml). Chú ý trong trường hợp mẫu dùng cho giải trình tự ADN tự động huỳnh quang thì hoà tan mẫu trong nước.

Nói chung sử dụng cột Qiagene thu được trên 90% ADN và thường được dùng cho tinh sạch Plasmid và cosmit (kích thước dưới 2 Kbs đến lớn hơn 50 Kbs). Số lượng plasmid thu nhận được từ tế bào E.coli phụ thuộc vào hệ tế bào chủ, loại plasmid từ thấp trung bình đến số lượng plamid cao và điều kiện nuôi cấy (có thể tham khảo tài liệu liên quan từ các chỉ dẫn của Qiagene để quyết định số lượng tế bào dùng để xử lý cho mỗi loại kích thước cột).

     Chú ý cách làm sạch và tái sử dụng cột:

     1, Thêm ethanol đầy vào cột, ly tâm.

     2, Bỏ ethanol và ly tâm lại một lần nữa.

     3, Lặp lại bước 1 và 2 với nước cât.

     4, Giữ cột ở trạng thái khô cho đến lần sử dụng về sau.

     (Cột có thể được dùng cho nhiều lần tuy nhiên khi muốn tinh sạch ADN dùng cho tách dòng thì nên dùng cột mới).

 Các loại dịch đệm dùng cho cột Qiagene:

 

6.2. Phương pháp 2. Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN

* Giới thiệu chung:

Phương pháp này giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tự ADN. Có nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác nhau để chọn cách tiện ích nhất.

Điều quan trọng nhất là các bản kính phải được rửa sạch tuyệt đối.

1, Mang găng tay và loại bỏ hết bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với nước nóng. Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng tương đương. Sau đó rửa sạch lại bằng nước.

2, Rửa các bản kính với nước trao đổi ion sau đó dựng lên giá cho khô, tránh bụi bám vào kính. Lau với ethanol và dùng giấy Kimwipes hay Scott Utinity để lau cho sạch không tạo vết. Kiểm tra lại bụi bám vào kính để lau cho sạch, sau đó kính được lau bằng lớp dịch Rain-X hay Sigmacott, Gel Slick của hãng AT Biochem. Mục đích dùng chất này là giúp cho việc đổ gel dễ dàng hơn và gel không bị dính vào các bản kính.

3, Rửa lại bản đệm cách gel (spacer) với nước đặt vào dọc theo hai cạnh đối xứng của bản kính.

4, Ghép hai bản kính với nhau. Đặt cẩn thận hai bản kính bằng nhau sao cho hai bản spacer sát tận cuối bản gene (tạo mặt phẳng cùng với hai bản kính). Nếu không đảm bảo mặt phẳng thì dễ bị chảy gel trong quá trình đổ gel. Kẹp 2 cạnh của gel tại 3 vị trí.

5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long Ranger (Hoefer Rig).

Trộn đều hỗn dịch:

         16 ml Acrylamid Long Ranger (LR) 50%.

         5 ml 10X TBE

         70 ml 10M Urea (46 gam)

         Đưa đến thể tích 100 ml với nước

         Cho vào 800 μl 10% Ammonium persulphat.

         50 μl TEMED.

         Quá trình polyme hóa được thực hiện trong 15 -20 phút.

Chạy gel LR trong dải nhiệt độ 50-55^oC, nhiệt độ cao hơn 55^oC sẽ phá các liên kết acrylamid LR gel là dạng cải biến cho gel acrylamid có một số ưu điểm sau: Thứ nhất là LR gel với nồng độ cao hơn nhưng việc chạy gel thì cũng như gel có nồng độ thấp thông thường, ví dụ LR gel 5% tương đương 4% gel acrylamid với bisacrylamid Thứ 2 là LR gel có khả năng phân giải cao hơn và chạy với tốc độ nhanh hơn 30-40% gel thông thường, gel LR khô nhanh hơn và không bị dính.

* Hóa chất và cách chuẩn bị:

     Phương pháp: Giải trình tự ADN sợi kép sử dụng KIT biến tính nhanh với sequenase.

         Phương pháp này thích ứng với việc giải trình tự các plasmid sợi đôi. Bắt đầu bằng việc gây biến tính trong kiềm (NaOH) hoặc glycerol, sau đó kết tủa ADN và bắt cặp với ADN mồi dùng để giải trình tự. Phương pháp giải trình tự ADN với sợi đôi cần lượng ADN mồi cao gấp 10-20 lần so với sợi đơn. Việc giải trình tự gồm hai phản ứng: phản ứng đánh dấu và phản ứng dừng tại điểm cuối. Trong phản ứng đánh dấu các sợi ADN bổ sung được gắn kết với chất đánh dấu phóng xạ trong việc kéo dài chuỗi. Sau đó phản ứng kéo dài chuỗi ADN bị dừng một cách ngẫu nhiên do nồng độ thấp của nucleotid trong dịch phản ứng (0.08 mM). Bước tiếp theo là kết thúc chỗi với dideoxynucleotid khi có nồng độ cao của deoxyribonucleotid (33,3 mM). Các trình tự tiếp theo của sợi khuôn sẽ được xác định với nồng độ cao của deoxynucleotid trong khi phản ứng đánh dấu xảy ra trước việc bổ sung dideoxynucleotid vào hỗn hợp phản ứng. Quy trình sau đây đã được rút gọn, có nhiều phần tiện ích chi tiết hơn và thay đổi trong các tài liệu hướng dẫn.

      Điều quan trọng để có kết quả tốt trong việc giải trình tự ADN là chất lượng cao của ADN plasmid. Trong các khâu chuẩn bị việc xuất hiện các phân tử đứt gãy sẽ dẫn đến kết quả không rõ, khó xác định các băng. Các plasmid sợi đơn phải được làm biến tính cho mở xoắn trước khi giải trình tự. Biến tính các plasmid xoắn do liên kết hóa trị không phải lúc nào cũng đạt được bằng xử lý nhiệt tại nhiệt độ bắt cặp mồi hay trong đệm phản ứng, bởi lẽ nhiệt độ mở xoắn thường là 105ng là 105^oC. Có hai phương pháp khá nhanh và tiện lợi: Một phương pháp xuất phát từ thực tế là glycerol hoặc ethylen glycerol có tác dụng làm giảm nhiệt độ mở xoắn, còn phương pháp thứ 2 là mở xoắn bằng môi trường kiềm. Cả hai phương pháp đều thực hiện đơn giản cho hầu hết các loại ADN khuôn.

Đối với hai phương pháp biến tính ADN, nên dùng lượng ADN khuôn ở nồng độ 0.5 pmol (05- 0.3 mg) và lượng primer 2-5 pmpol. Nếu sử dụng thể tích ADN nhỏ hơn thì phải pha đến nồng độ thích hợp bằng nước. Kết quả tốt nhất thu được là theo tỷ lệ phân tử mồi : sợi khuôn là 4 : 1. Tỷ lệ này nên được duy trì khi tiến hành với lượng ADN khuôn khác nhau. Trong mọi trường hợp khi mà số lượng thành phần nào quá ít thì đều dẫn đến băng không rõ ở cuối bản gel. Lượng ADN khuôn cần theo phương pháp này ít hơn so với sử dụng sequenase KIT 2.0 do không bị mất ADN trong bước kết tủa với ethanol. Tác nhân gây biến tính ADN khuôn trong KIT này là đệm 40:50 glycerol và ethylen glycerol. Việc bổ sung đệm này vào dung dịch ADN theo tỷ lệ chỉ dẫn; 40% glycerol sẽ làm giảm nhiệt độ biến tính ADN xuống khoảng 20^oC. Chý ý khi dùng đệm glycerol sẽ gây nên việc di chuyển không đều trên gel điện di tại vùng có khoảng cách 300-400 kể từ đoạn ADN mồi. Nên sử dụng đệm chạy gel hạn chế tác dụng của glycerol (thay taurin cho đệm chạy gel TBE) sẽ khắc phục được điều này.

ADN plasmid sẽ biến tính tại bất kỳ nhiệt độ nào ở pH kiềm (pH 13). Điều quan trọng đối với phương pháp này là việc trung hòa bước biến tính kiềm bằng HCL phải được thực hiện một cách chính xác. Như vậy nên dùng một loại pipet cho việc bổ sung kiềm và trung hòa bằng acid HCL sau đó. Nói chung dung dịch NaOH và HCL được chuẩn bị có nồng độ 1M, trong trường hợp dùng hóa chất riêng phải đảm bảo nồng độ chỉ dao động trong khoảng 0,95- 1.05M. Bước gây biến tính kiềm và kết tủa với ethanol cũng có thể được thực hiện với các hóa chất trong KIT nhưng đôi khi cũng không đạt được kết quả mong muốn và cần phải cải tiến.

Trong trường hợp giải trình tự với ADN sợi đơn, không phải thực hiện bước biến tính ADN, hỗn dịch được chuẩn bị đơn giản gồm: ADN plasmid, 05 pmol primer, 2 ml đệm phản ứng và bổ sung nước cho đủ 15 ml.

Phản ứng tốt sẽ đọc được trình tự dài khoảng 400 bps.

* Cách tiến hành cụ thể:

- Biến tính ADN (theo hai cách trình bày ở trên).

- Biến tính với glycerol:

ADN:                               0.5 – 0.3 mg (thể tích tối đa 7 ml).

Đệm biến tính plasmid:    5 ml.

Primer:                             1 ml.

Nước cất dẫn đến:            13 ml.                

Trộn đều, ủ trong 5 phút ở 90 – 100 ^oC, làm lạnh nhanh trên đá.

Bổ sung thêm đệm phản ứng: 2 ml để đạt được tổng thể tích là 15 ml.

                        B. Biến tính với kiềm (không cần kết tủa với ethanol).

     Thành phần phản ứng gồm:

         ADN:                    0.5 - 3mg  (thể tích tối đa là 8ml)

         NaOH 1M:            2 ml.

         Primer:                  1 ml.

         Nước cất dẫn đến: 11 ml.

              Trộn đều, giữ trong 10 phút tại 37^oC, làm lạnh nhanh trên đá.

Điều quan trọng trong phương pháp này là bước trung hòa phải được thực hiện chính xác với HCL.

              Sau đó bổ sung HCL 1M : 2 ml.

              Đệm phản ứng plasmid:     2 ml.

              Tổng thể tích là:                15 ml.

2.     Bắt cặp mồi vào sợi khuôn:

Giữ hỗn dịch ADN và mồi ở 37^oC trong 10 phút, sau đó giữ trên đá lạnh (mẫu chỉ nên dùng trong vòng 4 giờ).

3.     Chuẩn bị tube chứa hỗn dịch kết thúc chuỗi:

Trong khi thực hiện bước bắt cặp sợi khuôn và sợi mồi, tiến thành hút 2,5 ml hỗn dịch kết thúc chuỗi cho từng loại (ddA, ddC, ddG, ddT) cho vào từng tube riêng biệt. Đậy nắp, để trên đá để dùng cho các bước 5 và 7.

         4. Pha loãng dịch đánh dấu:

Pha loãng dịch đánh dấu 5 lần với nước và giữ trên đá. Không nên pha loãng dịch đánh dấu khi muốn đọc đoạn ở xa mồi.

                  Dịch đánh dấu: 2 ml

                  Nước:               8 ml

                  Tổng số:           10 ml.

5. Làm ấm các mẫu đá chuẩn bị trong bước 3:

Bốn mẫu được chuẩn bị trong bước 3 lần lượt là ACGT được ủ ở 37^oC trong 1 phút.

6. Phản ứng đánh dấu (kể từ bước này thì mọi đầu côn và pipét sẽ thực hiện với hóa chất phóng xạ, do đó cần phải có các biện pháp bảo vệ và đeo găng tay).

Bổ sung lần lượt các thành phần sau vào 15 ml hỗn dịch bắt cặp đã được chuẩn bị trong bước 1.

         DTT 0.1M :                                         1 ml

         Dịch đánh dấu (bước 4):                     2 ml

         Hóa chất phóng xạ: S³⁵ (P³³, P³²):       0.5 ml

         Enzym T7 sequenase cho plasmid:      2 ml

         Tổng thể tích :                                  20.5 ml

    (Thể tích này sẽ được chia ra 4 phần trong bước 7)

Trộn đều (tránh bọt), ủ hỗn dịch tại nhiệt độ phòng 2 -5 phút (đối với plasmid làm biến tính trong glycerol thì ủ 5-10 phút tại nhiệt độ phòng hoặc 5 phút tại 37^oC). Thường bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid cuối cùng, sau khi các thành phần khác đã được bổ sung. Không bao giờ bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid vào hỗn dịch đánh dấu, DTT hay hỗn dịch khác không phải là đệm.

Chú ý: Nếu trong trường hợp chất phóng xạ S³⁵ để quá lâu thì có thể tăng lượng lên 2 ml cho mỗi phản ứng, sau đó giảm lượng nước tương ứng.

7. Phản ứng kết thúc chuỗi:

a. Lấy 4,5 ml hỗn dịch thu được từ bước 6 cho vào thành trên của 4 tube kết thúc chuỗi đã được làm ấm ở bước 5 (A, C, G, T). Đậy nắp lại và li tâm nhanh để trộn đều, tiếp tục ủ trong 5 phút tại 37^oC (có thể kéo dài tới 30 phút). Nếu thấy cần thiết thì có thể li tâm nhanh để thu lấy hỗn dịch trước khi tiến hành phản ứng đánh dấu.

b. Tại thời điểm cuối của 5 phút, bổ sung 4 ml hỗn dịch dừng phản ứng vào thành trên của các tube và đóng nắp nhanh. Như vậy có thể dừng phản ứng tại thời gian thích hợp bằng cách li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng.

c. Ngay lập tức li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng, sau bước này phản ứng đánh dấu đã hoàn tất và mẫu có thể được giữ ở 4 ^oC để sử dụng trong ngày hôm sau.

d. Xử lý ở nhiệt độ 75^oC cho các mẫu khoảng 2-3 phút ngay trước khi tra mẫu lên gel, với các mẫu chứa glycerol thì việc lên mẫu dễ dàng với đầu côn vàng.

e. Lên khoảng 2-3 ml mẫu cho mỗi giếng trên gel giải trình tự. Nên đưa một lượng đồng mẫu trên các giếng. Cách tốt nhất để lên mẫu không bị bọt là hút 3 ml mẫu nhưng khi tra chỉ dùng 2 ml là đủ.

Hóa chất:

 Hỗn dịch kết thúc chuỗi:

 

Tube	A	C	G	T
dATP	80μM	80μM	80μM	80μM
dCTP	80μM	80μM	80μM	80μM
7-deaseGTP	80μM	80μM	80μM	80μM
dTTP	80μM	80μM	80μM	80μM
ddATP	8μM
ddCTP		8μM
ddGTP			8μM
ddTTP				8μM
NaCl	50 mM	50 mM	50 mM	50 mM

            Dịch dừng phản ứng:

                   95% Formamide

                   20mM EDTA (Na2), pH 8.0

                   0.05% Bromopheno Blue (BPB).

                   0.5% Xylen CyanolFF (XC).

         Chú ý, nếu bạn gặp trục trặc với việc giải trình tự ADN thì các plasmid nên được tái tinh sạch với Genee-Clean hoặc sắc ký trao đổi ion.

Các phần dưới đây đề cập đến một số vấn đề nảy sinh và cách giải quyết khi tiến hành giải trình tự ADN.

- Muốn đọc được trình tự ADN dài hơn:

Yêu cầu đầu tiên là phải đọc được đoạn gene đến mức có thể trên gel. Thông thường thì kích thước đọc cho mỗi phản ứng trên gel là 250-300 nucleotid. Với thời gian chạy gel lâu khoảng 8 giờ thì có thể đọc được kích thước gene dài hơn 400 nucleotid. Nếu sử dụng gel gradient sẽ không phù hợp cho mục đích này vì khoảng cách giữa các băng ADN sẽ hẹp tới mức không thể đọc được. Nồng độ gel acrylamid dao động 4-6% là thích hợp cho kết quả tốt. Có một giải pháp nữa là có thể sử dụng gel với gradient muối nhưng vẫn giữ nguyên thời gian chạy gel (xem phương pháp 2, bước 16).

- Sự dồn các băng:

Nguyên nhân chung để không thể hoàn tất việc giải trình tự ADN là các băng không rõ do cấu trúc bậc hai trong sản phẩm của phản ứng kéo dài chuỗi, điều này thường được mô tả là sự dồn ép các băng do các băng bị thu hẹp một cách bất thường trên ảnh fim của kết quả giải trình tự ADN. Các khoảng cách hoàn toàn như nhau khi mà khoảng 3 liên kết G-C bổ sung kèm với 2-5 base có thể dẫn đến kết quả không thể đọc được đoạn gene chiếm một khoảng nhỏ trên bản gel. Khoảng trống bất thường là do ảnh hưởng của chuỗi với khoảng cách ngắn của cấu trúc bậc 2 sẽ có cùng tốc độ di chuyển như là sợi thẳng có chiều dài ngắn, tại ví trí bản fim ngoài vùng dồn băng thì khoảng cách các băng sẽ rộng khác thường do sự kém bền của cấu trúc bậc 2 làm cho chiều dài của chuỗi tăng lên và sự di động của chuỗi trở nên như bình thường.

Việc giải trình tự qua vùng gene dồn nén có thể được khắc phục bằng cách thực hiện việc đọc trình tự trên cả hai sợi. Sự bất thường về việc di chuyển nảy sinh ở các chuỗi có chiều dài không đủ cho việc bắt cặp. Điều này có nghĩa vùng gene có các băng không rõ ràng sẽ được khắc phục bằng cách sử dụng dITP thay cho dGTP trong phản ứng giải trình tự ADN. Lý do là base I chỉ có 2 liên kết với C thay vì 3 liên kết trong trường hợp với G, kết quả là ADN sẽ dễ duỗi hơn. Kỹ thuật này thường được dùng, do đó dITP có trong KIT sequenase.

Một cách khác có thể làm kém bền vùng base dồn nén do còn cặp đôi đó là thực hiện chạy gel trong điều kiện biến tính (ví dụ sử dụng formamide trong nước dùng đổ gel). Trong trường hợp này khi thay thế 25% formamide cho nước sẽ đạt được kết quả tốt nhất. Gel có formamide thường được dùng khi vùng dồn nén khá gần mồi, nên xử lý formamide qua gel trao đổi ion ngay trước khi chuẩn bị gel.

Trong các trường hợp mà các cấu trúc cặp đôi phức tạp hơn khi mà vùng dồn nén lại nằm ngay tại vị trí tương đồng trên sợi đối diện. Khi đó cách giải quyết sẽ trở nên khó khăn vì với các kỹ thuật hiện có thường đưa lại các kết quả khác nhau.

- Cường độ các băng thiếu sự đồng nhất:

Một vấn đề khác trong phản ứng giải trình tự ADN là cường độ các băng không đồng nhất. Điều này thường xuất hiện trong phương pháp giải trình tự với thiết bị tự động dựa vào phương pháp phát hiện bức xạ huỳnh quang. Sự thiếu đồng nhất là do sự có mặt của sequenase cần Mg⁺⁺ gắn dideoxy kết thúc chuỗi khác nhau tại các vị trí khác nhau (vấn đề này được bàn luận kỹ trong tài liệu USB sequenase).

 7. Kỹ thuật giải trình tự ADN trên thiết bị giải trình tự ADN tự động:

 

 Hình 2. Thiết bị giải trình tự ADN tự độngg

(3100-Avant Genetic Analyzer)

             Trong phần này chúng tôi đề cập phản ứng giải trình tự ADN trên 2 loại thiết bị chủ yếu hiện đang được dùng phổ biến là: Beckman Coulter và ABI 3100-Avant

Thành phần phản ứng (cho 1 phản ứng 20 ml):

- Terminator Ready Reaction Mix*: 8 μl

- Template:                                        80-100 ng

              ( với plasmid là:                  300ng)

- Primer :                                           3.2 pmol

- Nước cất vô trình:                      đủ 20 μl

Chuẩn bị Teminator Ready Reaction Mix cho 4 phản ứng:

15 μl Bigdye Sequencing Buffer 3.1 (5X) + 15 μl nước = 30 µl (2.5X)

20 μl đệm 2.5X + 20 μl Ready Reaction Premix= 40 μl Terminator Ready Reaction Mix (dùng 8 μl) cho một phản ứng.

Tiến hành phản ứng:

Phản ứng được thực hiện trong 200 ml tube hay trong microplate.

Cycling được thực hiện trong máy PCR theo chương trình sau:

         Denature 96^oC:    1 phút

96 ^oC:                  10 giây

50^oC:                   5 giây

60^oC:                   4 phút

Cycling:              25 cycles.

Kết tủa sản phẩm PCR:

         - Cho vào 5µl EDTA 125 mM  + 60µl E-OH 100%E-OH 100%

         - Trộn đều, để 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15 000 v/phút

         - Rửa lại bằng 60µl E-OH 70% và lại ly tâm (4^oC)

         - Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng (Speed Vac).

- Khi mẫu khô, thêm 10µl Hi-Di formamide, trộn đều sau đó ủ ở 96^oC trong 2 phút.

         - Để trên đá trước khi cho vào seq.

         4. Đưa mẫu vào máy đọc trình tự.