- Báo cáo

Báo cáo_Đánh giá khả năng sinh trưởng của các loài vi tảo sau thời gian lưu giữ[14/12/2021]

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN I

TRUNG TÂM QUỐC GIA GIỐNG HẢI SẢN MIỀN BẮC

BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CÁC LOÀI VI TẢO SAU THỜI GIAN LƯU GIỮ

Cát Bà tháng 12/2021

PHẦN I. MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của chuyên đề

Lưu giữ giống vi tảo chính là bảo quản vi tảo liên tục trong những điều kiện môi trường có kiểm soát nhằm duy trì những dặc điểm vốn có của giống loài. Quá trình lưu giữ được thực hiện theo định kỳ bằng kỹ thuật vi sinh vô trùng và sử dụng chất bảo quản vào cuối pha tăng trưởng của vi tảo. Điều này có nghĩa là trong môi trường giữ giống các hoạt động của vi tảo vẫn diễn ra xong bị hạn chế, theo thời gian bảo quản giữ lại những tế bào có sức chịu đựng tốt nhất trước khi đưa giống trở về trạng thái tối ưu ban đầu. Tuy nhiên, quá trình sống sót của quần thể tảo lưu giữ có sự phụ thuộc vào trạng thái của tế bào trong từng pha sinh trưởng của chu kỳ nuôi. Điều này phụ thuộc rất lớn vào tình trạng dinh dưỡng của quần thể vi tảo trước khi vào trạng thái bảo quản tĩnh.

Hiện nay, quá trình giữ giống vi tảo lâu dài được thực hiện trên những nước phát triển có thiết bị và đầu tư trang bị hiện đại cũng như có trình độ nghiên cứu chuyên sâu, điều này hầu như các nước khác áp dụng rất khó khăn do thực tiễn còn nhiều hạn chế. Chính vì vậy, sức sống của vi tảo giống theo thời gian bị giảm hay nói cách khác là thoái hóa giống. Nếu quá trình lưu giữ giống và quá trình nhân nuôi sinh khối diễn ra không đồng bộ và thiếu cụ thể sẽ diễn ra tình trạng giống sau khi lưu giữ nhân nuôi trở lại trong điều kiện không phù hợp sẽ bị chết, gây thiệt hại tới kinh tế cho người sử dụng. Mặt khác một số nước có ngành thủy sản phát triển vẫn thường xuyên thực hiện quá trình di nhập giống vi tảo từ các ngân hàng vi tảo trên thế giới. Tuy nhiên, chi phí cho quá trình mua giống vi tảo cũng như vận chuyển rất cao, đồng thời việc đảm bảo giống trở lại trạng thái nguyên đặc tính rất khó khăn nếu như cách tiến hành ban đầu không phù hợp. Điều này dẫn tới hậu quả giống vi tảo mua về bị chết hoặc sức sống bị giảm đi.

Các hình thức cơ bản lưu giữ giống tại Việt Nam hiện nay vẫn là: lưu giữ giống vi tảo trên thạch agar dinh dưỡng, lưu giữ vi tảo lỏng trong các bình tam giác. Hai hình thức lưu giữ giống này chủ yếu chọn giống qua hình thái của tế bào, mặc dù vẫn giữ được giống qua thời gian, nhưng việc chọn lọc gặp nhiều khó khăn đặc biệt là tốn rất nhiều thời gian

Những khó khăn về đầu tư trang thiết bị, phương pháp sử dụng làm giảm hiệu quả trong lưu giữ giống và nuôi sinh khối vi tảo. Tiêu biểu cho những hạn chế đó là chất lượng vi tảo giống lưu giữ còn thấp, hiện tượng bị tạp nhiễm bởi một số loài tảo không mong muốn vẫn có khả năng xảy ra. Đặc biệt hạn chế lớn nhất trong khâu lưu giữ giống vi tảo của chúng ta là khó khăn trong việc duy trì giống tảo gốc trong thời gian dài. Việc nuôi sinh khối vi tảo trong các trại sản xuất còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường đặc biệt là nhiệt độ và ánh sáng. Sự thay đổi của các yếu tố môi trường thường hạn chế khả năng phát triển của vi tảo nuôi sinh khối thậm chí làm cho tảo nuôi sinh khối chết hàng loạt ảnh hưởng đến ương nuôi giống hải sản.. Chính vì vậy, giống vi tảo sau khi được chọn lọc đảm bảo phát triển một cách toàn diện, ưu thế và đầy đủ nhất. Sau khi giống được chọn lọc trong quá trình lưu giữ, một bước quan trọng không thể thiếu trước khi đưa giống trở lại nuôi trong điều kiện nuôi sinh khối lớn chính là thực nghiệm kiểm chứng giống trong phòng thí nghiệm. Giống sau khi được nuôi thử nghiệm và nuôi đạt trạng thái ổn định mới chuyển ra bên ngoại nuôi thực tế.

Trên cơ sở những vấn đề đặt ra, chúng tôi thực hiện chuyên đề: “Đánh giá khả năng sinh trưởng của các loài vi tảo sau thời gian lưu giữ”

Mục tiêu nghiên cứu

Duy trì và kiểm xoát chất lượng nguồn giống vi tảo thuần hiện có, sẵn sàng cung cấp nguồn tảo giống thuần cho các đơn vị sử dụng

Nâng cao hiệu quả nuôi sinh khối vi tảo cũng như đảm bảo sinh khối vi tảo làm thức ăn ương trong các công nghệ sản xuất giống.

Cung cấp thêm các dẫn liệu khoa học nhằm từng bước hoàn thiện quy trình kĩ thuật lưư giữ và nhân nuôi sinh khối thực vật phù du của Trung tâm.

Nội dung nghiên cứu

- Lưu giữ an toàn 5 nguồn gien vi tảo biển: Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros muelleri và Thalassiosira pseudonana.

- Đánh giá chất lượng 5 nguồn gien vi tảo được lưu giữ trên trong điều kiện nhân nuôi sinh khối trở lại.

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Đặc điểm sinh học

2.1.1. Nannochoropsis oculata

2.1.1.1. Phân loại

Dựa theo hệ thống phân loại của Van Den Hoek (1995) đã xác định:

Ngành: Heterokontophyta

Lớp: Eustigmatophyceae

Bộ: Eustigmatales

Họ: Eustigmatos

Chi: Nannochloropsis

Loài: Nannochloropsis oculata (Droop) Hibber-1981

2.1.1.2. Hình thái

N. oculata đơn bào, dạng khối cầu hoặc hơi hình trứng, kích thước dài
2 - 4µm, không có roi nên không có khả năng tự di động trong môi trường sống . Trong môi trường nuôi tế bào sống ở dạng trôi nổi và trạng thái lơ lửng khi môi trường không có sục khí.

2.1.1.3. Cấu tạo

Năm 1986, Murayama đã nghiên cứu cấu trúc hiển vi của tế bào
N. oculata dưới kính hiển vi điện tử cho thấy, tế bào có một nhân. Thể sắc tố quang hợp chỉ có một thể sắc tố hình trứng. Thể sắc tố được bao bọc bởi hai lớp màng, lớp màng ngoài dính liền với màng nhân. Trong thể sắc tố có nhiều bản sắc tố, mỗi bản sắc tố gồm 3 phiến sắc tố xếp song song nhau, không có đai nối giữa các phiến sắc tố. Sắc tố quang hợp duy nhất tìm thấy ở N. oculata là Chlorophyl a, không có sắc tố quang hợp Chlorophyl b và c. Đây được coi là một đặc trưng sinh hoá chủ yếu để phân loại Nannochloropsis nói riêng và ngành Eustigmatophyta nói chung, ngành chỉ có Chlorophyl a mà không có Chlorophyl b và c. Các carotenoid bao gồm carotene 11%, violaxathin 51%, vaucheriaxanthin 26%, và các carotenoid khác chiếm 12%.

2.1.1.4. Sinh trưởng

Ánh sáng: với vi tảo, ánh sáng rất cần thiết cho quá trình quang hợp vì chúng là nguồn năng lượng để có thể chuyển hoá các chất vô cơ thành các chất hữu cơ cần thiết cho quá trình sống. Theo Hoff và Snell (1999) cường độ ánh sáng 1000 – 5000lux và chu kỳ quang giờ sáng/tối là 16/8 hoặc 24/0 là phù hợp nhất cho sinh trưởng của N. oculata.

Nhiệt độ: theo Hoff và Snell (1999) N. oculata là loài có khả năng thích nghi với sự biến động về nhiệt độ rộng, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 20 – 30^oC. Tuy nhiên, Liao và cs (1991) cho biết N. oculata sinh trưởng kém nếu nhiệt độ dưới 16^oC hoặc trên 28^oC; ở nhiệt độ 22 – 26^oC với điều kiện dinh dưỡng tốt, cường độ ánh sáng phù hợp thì loài vi tảo này phát triển rất nhanh.

Độ mặn: cũng theo Hoff và Snell (1999) N. oculata có thể sinh trưởng được trong khoảng dao động lớn của độ mặn từ 0 - 36‰. Bên cạnh đó, nghiên cứu của Phạm Thị Lam Hồng (1999) cho kết quả sinh trưởng tốt nhất của tảo N. oculata ở độ mặn 30 – 35 ‰, nhưng có thể phát triển ở độ mặn 10 – 35 ‰. Tuy nhiên, theo Vũ Dũng (1998) N. oculata phát triển tốt ở độ mặn 18 – 26 ‰.

pH: phát triển được trong khoảng 6,4 – 9,6 nhưng tối ưu là 7,8 – 8,2 và thay đổi theo tốc độ sinh trưởng của N. oculata. Nếu tốc độ sinh trưởng càng nhanh thì pH càng tăng nhanh thuận chiều với quá trình lấy CO₂ trong nước.

2.1.1.5. Sinh sản

N. oculata sinh sản bằng cách phân đôi cơ thể từ một tế bào mẹ cho hai tế bào con giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu. Khi mới phân chia xong tế bào của chúng nhỏ hơn bình thường nên dựa vào đặc điểm này mà ta có thể biết được tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh sản của quần thể vi tảo đang nuôi.

2.1.2. Isochrysis galbana

2.1.2.1. Phân loại

Dựa theo hệ thống phân loại của Van Den Hoek (1995), đã xác định:

Ngành: Haptophyta

Lớp: Haptophyceae

Bộ: Isochrysidales

Họ: Isochrysidaceae

Chi: Isochrysis

Loài: Isochrysis galbana Parke 1949

2.1.2.2. Hình thái

I. galbana sống đơn bào, hình thoi dài hoặc hình tròn. Kích thước tế bào dài khoảng 5 – 7µm. Vi tảo có hai roi bằng nhau hoặc gần bằng nhau, sợi bám ngắn thường hay biến mất, mỗi roi dài khoảng 7µm nên chúng có khả năng di động nhanh trong nước theo kiểu quay tròn tịnh tiến.

2.1.2.3. Cấu tạo

Thể lục lạp của I. galbana có dạng hình chén và chiếm khoảng 1/3 thể tích của tế bào. Sắc tố chủ yếu I. galbana là Chlorophyl a, c, Carotenoid chứa nhiều fucoxanthin đặc trưng nên khi quan sát trên kính hiển vi điện tử các tế bào I. galbana có màu vàng đậm đến màu nâu nhạt. Chính vì vậy, một số tác giả xếp I. galbana vào lớp tảo vàng ánh.

2.1.2.4. Sinh trưởng

Ánh sáng: theo Frank H. Hoff và Terry W. Snell (1987) thì I. galbana có thể chịu được cường độ chiếu sáng từ 2500 – 10000 lux nhưng tốt nhất ở ánh sáng 5000 – 8000 lux . Trong điều kiện không có ánh sáng kết hợp với để ở nhiệt độ thấp thì I. galbana dễ bị tàn. Vì thế để đảm bảo rằng việc nuôi sinh khối cũng như lưu giữ giống loài vi tảo này đạt hiệu quả cao cần phải chiếu sáng liên tục trong ngày.

Nhiệt độ: Frank H. Hoff và Terry W. Snell (1987) thì I. galbana có ngưỡng nhiệt độ tối ưu là 25⁰ – 30⁰C. Đây là loài khó thích nghi được với điều kiện nhiệt độ thấp, nếu đưa các tế bào vi tảo này vào nhiệt độ dưới 10⁰C chúng chỉ sống được một thời gian rất ngắn hoặc có thể bị chết

Độ mặn: phù hợp nhất cho I. galbana phát triển vẫn là 10 – 30‰.

pH: I. galbana có thể thích nghi được điều kiện pH thấp hơn N. oculata nhưng phù hợp nhất trong khoảng từ 5 – 9.

2.1.2.5. Sinh sản

I. galbana cũng theo hình thức phân cắt làm hai tế bào con giống tế bào mẹ ban đầu. Điều đặc biệt của I. galbana là khi sinh sản một đầu tế bào thường to hơn đầu còn lại và xuất hiện eo phân cắt ở giữa tế bào nên rất dễ nhận thấy khi quan sát dưới kính hiển vi.

2.1.3 Chaetoceros calcitrans

2.1.3.1 Phân loại

Ngành Heterokontophyta

Lớp Bacillariophyceae

Bộ Coscinodiscales

Họ Chaetocerotaceae

Chi Chaetoceros

Loài Chaetoceros calcitrans Pausen, 1905

2.1.3.2 Hình thái

Theo S.W. Jeffrey, M.R. Brown and C.D. Garland (1994) mô tả, tế bào của C. calcitrans có dạng hình hộp lồng, tế bào hình vuông hoặc hình chữ nhật. Ở 4 góc có 4 gai tương đối dài. Kích thước tế bào tảo C. calcitrans từ 3 - 6µm. Thường sống đơn độc.

2.1.3.3 Cấu tạo

Tế bào gồm hai mảnh vỏ (lớp trong là pectin, lớp ngoài là dioxyd silic (SiO₂. 7H₂O)), có cấu trúc như hai nắp của cái hộp lắp vào nhau, bên trong chứa tế bào chất (Đặng Thị Sy, 2005). Có khả năng di động nhờ nội chất chuyển động trong các khe trên thành tế bào. Thành phần sắc tố có diệp lục a, c, caroten và xanthophin.

2.1.3.4 Sinh trưởng

Nhiệt độ: theo Brown (1994) C. calcitrans phát triển khá tốt trong khoảng nhiệt độ 10-30^oC. C. calcitrans hầu như không phát triển hoặc rất chậm trong điều kiện dưới 10^oC, phát triển tốt trong khoảng nhiệt 15-25^oC.

Độ mặn: Brown (1994) cho biết C. calcitrans có giới hạn chịu độ mặn rộng trong khoảng 7-35‰. Tuy nhiên, C. calcitrans phát triển tốt ở độ mặn 21-35‰.

pH: thay đổi theo tốc độ phát triển của vi tảo nhưng pH tốt nhất cho sự phát triển của vi tảo là 8,2 – 8,7.

2.1.3.5 Sinh sản

Sinh sản dinh dưỡng là chủ yếu, khi sinh sản nội chất của tế bào phân đôi đồng thời hai mảnh vỏ tách ra mỗi nửa nội chất nhận một mảnh vỏ của tế bào mẹ, sau đó tự tổng hợp nên vỏ thứ hai (Đặng Thị Sy, 2005). Hai tế bào của thế hệ sau mới sinh ra nhỏ hơn tế bào mẹ ban đầu nhưng sau một thời gian sinh trưởng chúng phát triển đạt kích thước như tế bào mẹ ban đầu. Đôi khi có xảy ra hiện tượng sinh sản hữu tính nhưng thường rất hiếm vì phải đặt vào trong điều kiện bão hoà dinh dưỡng nuôi liên tục trong thời gian dài.

2.1.4. Chaetoceros muelleri

2.1.4.1 Phân loại

Ngành Bacillariophyta

Lớp Centrophyceae

Bộ Biddulphiales

Họ Chaetocerotaceae, Ralfs in Pritchard

Giống Chaetoceros, Ehrenberg

Loài Chaetoceros muelleri, Lemm.

2.1.4.2 Hình thái

Tảo có dạng hình hộp lồng. Tế bào hình vuông, chữ nhật, 4 góc có 4 gai tương đối dài. Kích thước tảo nhỏ, giao động từ 3,5-4,6 × 4,5-9,2 µm. Thường sống thành từng tập đoàn dạng chuỗi nhờ các lông gai móc nối nhau, ít khi sống đơn độc (Đặng Thị Sy, 2005).

2.1.4.3 Cấu tạo

Tế bào gồm 2 mảnh cấu thành lớp trong là pectin lớp ngoài là chất silic. Hai mảnh vỏ có cấu trúc như 2 nắp của hộp lồng ghép vào nhau, bên trong chứa tế bào chất gồm các sắc tố: diệp lục a, c, caroten và xanthophin.

2.1.4.4 Sinh trưởng

Ánh sáng: theo Frank H. Hoff và Terry W. Snell (1987) C. muelleri phất triển trong khoảng 8000 – 10000 Lux là tối ưu. Trong quá trình nuôi ánh sáng bị che lấp ngày càng nhiều khi mật độ tế bào ngày càng cao vì vậy cần phải sục khí liên tục để tốc độ sinh trưởng không bị gián đoạn.

Độ mặn:cũng theo Frank H. Hoff và Terry W. Snell (1987) C. muelleri có giới hạn độ mặn khá cao 20 - 35‰. Khi độ mặn giảm dưới 15‰ tế bào gần như không phân chia hoặc bị vỡ tế bào.

Nhiệt độ: Cũng giống như các loài tảo silic khác C. muelleri có ngưỡng nhiệt chịu đựng cao nằm trong khoảng 25 – 35^oC. Khi nhiệt độ cao trên 30^oC phải chú ý tới quá trình cung cấp dinh dưỡng để tránh sự phát triển nhanh mà thiếu hụt dinh dưỡng dẫn tới pha tăng trưởng giảm dần mật độ.

2.1.4.5 Sinh sản

Hình thức sinh sản dinh dưỡng vẫn là chủ yếu, khi sinh sản nội chất của tế bào phân đôi đồng thời 2 mảnh vỏ tách ra mỗi nửa nội chất nhận 1 mảnh vỏ của tế bào mẹ rồi tổng hợp mới mảnh thứ hai (Đặng Thị Sy, 2005).

2.1.5 Thalassiosira pseudonana

2.1.5.1 Phân loại

Ngành:Bacillariophyta

Lớp Centrophyceae

Bộ Discales

Họ Thallassiosiraceae

Giống Thalassiosira

Loài Thalassiosira pseudonana

2.1.5.2 Hình thái

T. pseudonana thuộc bộ tảo hình đĩa. Đây là loài sống đơn độc hoặc theo tập đoàn. Tập đoàn tảo được tạo thành do các tế bào nối với nhau bằng mấu dạng ống hoặc sợi keo. Tế bào hình hộp tròn, mặt cắt ngang hình tròn. Mặt phẳng hoặc không. Kích thước trung bình từ 4-5 µm [Đặng Thị Sy, 2005].

2.1.5.3 Cấu tạo

Tế bào có nhân lưỡng bội bao bọc bởi 2 mảnh vỏ có cấu trúc như hai nắp của một cái hộp lắp vào nhau. Trên bề mặt vỏ có những hoa văn xếp theo kiểu đối xứng toả tròn có quy luật hoặc không. Chúng có cánh màng nhầy dùng để liên kết tế bào với nhau.

Nguyên sinh chất trong suốt làm thành lớp mỏng nằm ở phía dưới vách tế bào hay khối nhỏ ở trung tâm. Thành phần sắc tố gồm có diệp lục a, c, carotin và xanthophin. Sản phẩm đồng hoá cũng giống như các ngành trong nhóm sắc tố vàng là chrysolaminaran và dầu, thường tập trung thành từng giọt màu cam, ngoài ra còn có volutin cũng tập trung thành giọt nhưng có màu xanh lam.

2.1.5.4 Sinh trưởng

Nhiệt độ: theo S.H. Baek, cs thì nhiệt độ để Thalassiosira pseudonana phát triển tốt nhất từ 20 – 30^oC. Nhiệt độ thấp T. pseudonana phát triển kém nhất là khi ánh sáng yếu tảo bị sốc và đổi màu.

Độ mặn: T. pseudonana chịu ngưỡng độ mặn cao tốt hơn khi độ mặn thấp. Tuy nhiên, độ mặn tới hạn nằm trong khoảng 15 - 35‰, tối ưu là 22 - 28‰.

Ánh sáng: T. pseudonana chịu tác động mạnh bởi chu kỳ chiếu sáng và cường độ ánh sáng. Khi ánh sáng yếu tảo phát triển rất chậm, chu kỳ chiếu sáng không hợp lý làm tảo dễ bị sốc và chết. Tuy nhiên, cùng với nhiệt độ không quá cao thì đây là loài vi tảo có tính nhạy cảm với yếu tố ánh sáng.

2.1.5.5 Sinh sản

Hình thức sinh sản dinh dưỡng là chủ yếu. Khi sinh sản nội chất của tế bào phân đôi, đồng thời hai mảnh vỏ tách ra, mỗi nửa nội chất nhận một mảnh vỏ của tế bào mẹ rồi tổng hợp mới mảnh thứ hai. Khi gặp điều kiện bất lợi tảo có thể hình thành bào tử nghỉ bằng noãn giao.

2.2 Tổng quan nghiên cứu về môi trường dinh dưỡng nuôi vi tảo

2.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi tảo biển

Chất dinh dưỡng là yếu tố vô cùng quan trọng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo, quan trọng nhất chính là chất dinh dưỡng mà vi tảo được tích lũy trong quá trình nuôi. Để vi tảo phát triển mạnh, gia tăng mật độ cao nhất thì ngoài các yếu tố như độ mặn, nhiệt độ, ánh sáng có thể điều chỉnh theo thiết bị và dụng cụ, dinh dưỡng nước nuôi là yếu tố quyết định đến năng suất của vi tảo. Trong khi đó dinh dưỡng vi tảo được nâng cao hay giảm đi so với dinh dưỡng ban đầu ngoài tự nhiên là do dinh dưỡng mà vi tảo được nuôi. Mỗi loài vi tảo khác nhau có nhu cầu dinh dưỡng về từng thành phần và số lượng chất khác nhau.

Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của vi tảo có thể chia ra làm hai thành phần chính là đa lượng và vi lượng. Trong đó, thành phần đa lượng nuôi vi tảo bao gồm: muối của nito, photpho, silic (nếu là vi tảo silic sử dụng cho quá trình tạo nên vỏ ngoài của tế bào vi tảo). Thành phần vi lượng gồm một số ion kim loại cần thiết với hàm lượng thấp như Co (coban), Cu (đồng), Zn (kẽm), Mn (mangan), Fe (sắt).. và một số vitamin B₁, B₁₂, H...

Nhu cầu các chất đa lượng trong công thức môi trường dinh dưỡng nuôi vi tảo biển tập trung chủ yếu là nito, photpho và silic. Cụ thể:

Các muối nito thường được sử dụng là nito trong muối nitrite N- NO₃ và N- NH₄. Muối nito chính là thành phần quan trọng cấu tạo nên các protein và vitamin cung cấp cho vi tảo trong quá trình nuôi. Thông thường, nhu cầu nito của các loài tảo lục là cao nhất, nhu cầu nito thấp nhất với các loài vi tảo nâu (De Pauw và cs, 1983). Ví dụ: khi cường độ ánh sáng 2000 lux, nhu cầu nito với Chlorella sp. là 57mg/l, trong khi đó Nitzchia paka thích hợp là 5 – 10 mg/l, còn Chaetoceros calcitrans là > 10 mg/l (Utiing, 1985) .
Nito là yếu tố thúc đẩy quá trình phát triển của vi tảo thì photpho chính là yếu tố giới hạn cho sự phát triển của vi tảo. Mặc dù, hàm lượng photpho không nhiều trong môi trường nuôi nhưng lại là chìa khóa của quá trình trao đổi chất của tế bào (Huckison, 1957, trích theo Trần Văn Vỹ, 1995). Theo Zyceb (1952) thì vi tảo silic, tảo lục và tảo lam phát triển mạnh ở hàm lượng photpho giới hạn từ 0,1 – 0,8 mg/l, nếu hàm lượng photpho này nhỏ hơn 0,005 mg/l thì vi tảo phát triển kém hoặc chết. Nhiều thí nghiệm cho thấy: trong quá trình nuôi vi tảo nước ngọt và vi tảo biển ở mức độ dinh dưỡng cao hơn đặc biệt là nito và photpho cóthể kéo dài tuổi thọ của vi tảo nuôi. Vấn đề này được Bischoff và Bold (1963) thử nghiệm trên một số vi tảo và kết quả kéo dài được chu kỳ sinh trưởng của vi tảo trong vòng vài tháng (Sato, 1991).
Silic là yếu tố cấu tạo nên vách tế bào vi tảo đối với các loài vi tảo có cấu tạo vỏ bao gồm silicate, tế bào có xu hướng vỡ hoặc tách tế bào trong quá trình sinh trưởng thường gặp khó khăn nếu thiếu silic. Theo Gusep (1952), tảo silic phát triển tốt ở hạm lượng 1- 3 mg/l.

Các nguyên tố vi lượng bao gồm các muối kim loại với nồng độ thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình trao đổi chất của vi tảo, quan trọng nhất là sắt. Sắt có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển điện tử, quan phân ly nước và quá trình photpho hóa quang hợp. Hàm lượng sắt cần cho quá trình sống của vi tảo nằm trong khoảng 2 – 3 mg/l với các loài vi tảo silic nhưng lại là mức có thể gây chết với một số loài khác.

Vitamin bổ sung vào môi trường dinh dưỡng cho vi tảo nhằm mục đích tăng cường các hoạt động trao đổi chất của vi tảo bền bỉ hơn. Trong đó, vitamin thường sử dụng trong quá trình nuôi vi tảo biển bao gồm: B₁, B₁₂ và H (với các loài vi tảo có roi).

2.2.2 Một số nghiên cứu về môi trường dinh dưỡng của vi tảo trên thế giới

Thực vật phù du có vai trò quan trọng trong chu trình sinh địa và trao đổi chất, chiếm tới 50% năng lượng sản xuất cho toàn trái đất (Fied và cs, 1998). Thông qua quá trình hấp thu của nhiều các yếu tố dinh dưỡng như nito (N), photpho (P) hoặc sắt sẵn có trong nước để tạo ra nhiều các chu kỳ sống khác nhau trong tự nhiên.

Năm 1890 Beijerin là người đã tiến hành phân lập và nuôi tảo thuần sạch đầu tiên trên thế giới, đánh dấu nhiều công trình nghiên cứu tìm ra môi trường nuôi cho các loài vi tảo và các phương pháp nuôi thu sinh khối vi tảo sau đó. Sau vài thập niên, cùng với sự phát triển của việc sản xuất giống cũng như nuôi tôm biển trên một số nước đạt được thành công kéo theo những nghiên cứu về việc sử dụng vi tảo biển nhằm tăng tỷ lệ thành công trong các quy trình trên. Sớm nhất, 1946 tiến sĩ Hudinaga đã đề cập tới việc nuôi vi tảo bằng 2 phương pháp khác nhau nhằm thu được lượng vi tảo sinh khối cao nhất cho việc nuôi ấu trùng tôm bao gồm:

từ môi trường là nước biển tự nhiên, các loài vi tảo cần thiết được phân lập và nuôi trong môi trường có bổ sung chất dinh dưỡng, chiếu sáng và có sục khí. Loài vi tảo nuôi được chọn chủ động ngay từ ban đầu và loại bỏ những loài còn lại. Trong phương pháp này, Hudinaga đã chọn được Skeletonema costatum dùng cho ấu trùng tôm.
Phương pháp ‟cảm ứng nở hoa” sử dụng nước biển lọc thô, chỉ giữ lại một số loài vi tảo có sẵn trong nước để làm giống, có bổ sung phân vô cơ, chiếu sáng cho vi tảo phát triển. Tuy nhiên, phương pháp này không chủ động được sinh khối nuôi do khí hậu thay đổi thường xuyên.

Năm 1965 Glancy thực hiện nuôi vi tảo biển chỉ bằng phương pháp lọc thô nước biển bằng túi vải bông dày và chờ vi tảo phát triển mà không hề bón thêm bất cứ chất dinh dưỡng nào. Tuy nhiên, ngay cả phương pháp của Hudinaga cũng mang lại hiệu quả không cao. Kết quả của các phương pháp trên chỉ thu được một số loài vi tảo nhất định, do không thuần chủng và dinh dưỡng nuôi chưa phù hợp nên không duy trì được loài vi tảo thu thập được từ tự nhiên trong thời gian dài.

Sau sự ra đời của môi trường dinh dưỡng của F/2 (Guillard & Ryther, 1962) là hàng loạt các nghiên cứu về môi trường dinh dưỡng được ra đời trong đó có: Walne (1970), môi trường cải tiến của Liao và Huang (1983), môi trường của Allen – Nelson, môi trường của Erd – Schreiber... Những nghiên cứu này sử dụng chung cho hầu hết các loài vi tảo mà không đặc biệt tập trung cho bất cứ loài vi tảo riêng biệt nào.

Các thí nghiệm của Rhee (1978) cho thấy: tốc độ tăng trưởng của thực vật phù du có ảnh hưởng bởi tỷ lệ N : P, tốc độ tăng trưởng cao khi tỷ lệ N : P cao trong một phạm vi hẹp giới hạn giá trị và khi tốc độ tăng trưởng của thực vật phù du thấp phản ánh giới hạn của P (N cao : P) hoặc N giới hạn (thấp N : P), tỷ lệ N : P trong môi trường dinh dưỡng phụ thuộc vào từng loài vi tảo riêng biệt.

Theo Chen (1995) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của tỷ lệ N/P tới 5 loài vi tảo biển khi sử dụng hai nguồn nitrogen có trong NH₄Cl và nitrogen có trong urea với nguồn photpho có trong NaH₂PO₄ thu được tỷ lệ N/P tối ưu ở các loài nghiên cứu như sau: Thalassiosira sp. là 30/1 và 20/1; Heterosigma akashiwo đều là 30/1; Chroomonas salina là 20/1 và 30/1, Chaetoceros gracilis là 40/1 và 60/1 và Alexandrium sp. là 10/1 và 30/1. Có thể nhận thấy, tỷ lệ N/P cao hơn so với những nghiên cứu về tỷ lệ N/P của Redfield là 16/1.

Nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cho thấy thực vật phù du thích nghi tốt với tỷ lệ N/P nằm trong khoảng từ 5 – 7. Tuy nhiên, tỷ lệ này lại phụ thuộc vào hàm lượng các chất có sẵn trong nguồn nước và nhu cầu tế bào thực vật phù du cần. Vi tảo nước mặn được nghiên cứu trung bình của 29 loài đã cho ra kết luận tỷ lệ N/ P trung bình là 17,7, gần bằng tỷ lệ N/P mà Redfied công bố. Và, trung bình tỷ lệ N/P mà vi tảo biển cần nằm trong khoảng 7,1 – 43,3 mà không bao gồm cấu tạo tế bào của chúng.

Những nghiên cứu về việc sử dụng môi trường dinh dưỡng cho quá trình phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối chủ yếu dựa vào những công thức chuẩn sẵn có đã được công bố: F/2 ( năm công bố 1962), Walne ( năm công bố 1966), Provasoli ES (năm công bố 1968)...trên thực tế do chất lượng nước thay đổi nên các thành phần dinh dưỡng tự nhiên trong nước cũng thay đổi theo. Chính vì vậy, trong quá trình sử dụng các công thức môi trường dinh dưỡng cần phải được điều chỉnh cho phù hợp nhằm đảm bảo hiệu quả quá trình phân lập, giữ giống và nuôi sinh khối tốt nhất.

Trên thực tế, hiện nay đang sử dụng công thức dinh dưỡng nuôi vi tảo biển trong điều kiện thuần gốc các loài thường sử dụng các muôi dinh dưỡng có nito và photpho cho tỷ lệ N/P nhỏ hơn tỷ lệ của Redfied sử dụng nhằm kéo dài chu kỳ sống của quá trình nuôi vi tảo. Tuy nhiên, do tính chất nước thay đổi theo từng vùng biển cũng như theo mùa nên quá trình điều chỉnh dinh dưỡng chủ yếu của 2 thành phần nito và photpho luôn phải diễn ra nhằm thích ứng cho quá trình sống của vi tảo được tồn tại.

2.2.3. Việc sử dụng môi trường dinh dưỡng nuôi vi tảo tại Việt Nam

Sự phát triển các hoạt động thủy sản tại Việt Nam chậm hơn các nước phát triển khác trong khu vực: Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan...nên Việt Nam được thừa hưởng nhiều thành quả nghiên cứu trước đó để áp dụng trong thực tiễn nhằm đạt hiệu quả kinh tế cao hơn.

Năm 1974, Vũ Dũng đã phân lập được loài Skeletonema costatum bằng ống hút mao quản trên kính hiển vi và nuôi nhân sinh khối ở môi trường Alen nelsson thành công. Từ năm 1975 – 1981, Vũ Dũng và Vũ Văn Toàn đã tiến hành hàng loạt các thí nghiệm chọn lọc môi trường và một số điều kiện sinh thái cho một số đối tượng vi tảo silic phục vụ cho quy trình sản xuất tôm giống. 1982 cũng chính 2 tác giả trên đã bổ sung thêm hàng loạt các công trình nghiên cứu mới trên một số loài vi tảo xanh và vi tảo vàng nhằm hoàn thiện phục vụ cho sản xuất giống hải sản. Cùng thời điểm, Lê Viễn Chí cũng đã thuần hóa và chọn lọc ra môi trường nuôi thích hợp cho Ch. pyrenoidisa.

Năm 1977 – 1979, tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, Trần Văn Vỹ và Trần Thị Tho lưu giữ được 2 loài Chlorella và Scenedesmus trong phòng thí nghiệm khi sử dụng môi trường 04 cải tiến, môi trường Pratt thuần khiết đạt được mật độ tế bào ban đầu nuôi cao hơn ngoài tự nhiên.

Năm 1995, Đặng Đình Kim và cs tại Viện công Nghệ Sinh học Hà Nội đã sử dụng thiết bị nuôi tăng tốc trong phòng thí nghiệm, để sản xuất giống vi tảo lục Chlorella sp. bằng dung dịch nuôi dưỡng là muối Na, N, K, P đơn giản có bổ sung thêm sắt. Mật độ vi tảo đạt được từ 40 – 50 triệu tb/ml.

Vài năm trở lại đây, cùng với sự phát triển của các quy trình sản xuất giống và nuôi thương phẩm của một số đối tượng lâu năm, theo quy mô rộng lớn hơn cũng như một số đối tượng hải sản mới, đã đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu và sử dụng giống vi tảo trong cả nước. So với miền Bắc thì ở miền Nam nước ta có nhiều thuận lợi hơn để phát triển vi tảo do: số ngày nắng nóng trong năm cao, độ ẩm thấp và biên độ giao động nhiệt độ nhỏ. Chính vì vậy, việc thuần hóa vi tảo tự nhiên sử dụng cho các đối tượng hải sản tiến hành dễ dàng hơn và đạt được nhiều thành quả hơn.

Hiện nay, số công trình nghiên cứu về nuôi và sử dụng vi tảo làm thức ăn cho từng loài riêng biệt còn rất ít. Công nghệ nuôi và lưu giữ giống không ổn định, đa số các cơ sở sản xuất còn thiếu giống thuần chủng hoặc thiếu thiết bị nuôi cũng như lưu giữ giống. Vì vậy, quy trình sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm của các đối tượng hải sản chưa đạt hiệu quả như mong muốn. Vì vậy, cần có những nghiên cứu xây dựng hoàn thiện các quy trình lưu giữ giống, nuôi sinh khối nhằm chủ động cung cấp thức ăn cho các cơ sở nuôi hải sản.

PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

3.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là 5 loài vi tảo: Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros muelleri, Thalassiosira pseudonana. Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Quốc gia giống Hải sản miền Bắc Cát Bà - Hải Phòng.

- Thời gian thực hiện: từ tháng 01/01/2021 đến tháng 31/12/2021

3.2. Phương pháp thực hiện

3.2.1 Các phương pháp chung

+ Vi tảo giống:

5 loài vi tảo N. oculata, I. galbana, C. calcitrans, C. muelleri và T. pseudonana sau khi nhập giống vào Trung tâm Quốc gia giống Hải sản miền Bắc được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm đảm bảo sống sót và phát triển được. Sau đó, vi tảo giống được kiểm tra trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần để xác định đúng chủng loại trước khi đưa vào quá trình giữ giống (kích thước, mầu sắc, độ thuần). Giống đạt yêu cầu về độ thuần thì tiến hành quá trình lưu giữ bằng 2 phương pháp trong môi trường lỏng và trên thạch.

+ Xử lý nước thí nghiệm:

Nước biển được sử dụng cho quá trình lưu giữ và nuôi cấy trở lại được lấy từ nguồn nước biển tự nhiên có độ mặn 27‰. Sau khi bơm, nước biển được đi vào hệ thống các ao chứa, chảy vào các ao lắng, được bơm lên bể lọc của hệ thống lọc cát cơ học, sau đó nước biển được lọc qua hệ thống lọc catrige từ 10µ, 1µ và lọc bằng lõi lọc cacbon trước khi đi vào quá trình xử lý nước nuôi cấy.

Nếu sử dụng cho quá trình lưu giữ và cấy giống trong các bình thuỷ tinh thì nguồn nước biển qua hệ thống lọc trên được tiệt trùng bằng cách đun sôi. Nếu sử dụng cho quá sinh nuôi sinh khối giống thứ cấp thì nguồn nước biển qua hệ thống lọc trên được xử lý bằng chlorine có nồng độ 100ppm và trung hoà nguồn nước sau 24 giờ xử lý bằng thiosulphat có nồng độ tương ứng nồng độ chlorine xử lý.

+ Pha chế môi trường:

Bảng 2: Công thức môi trường F/2 Guillard & Ryther năm 1962 (pha trong 1 lít)

STT	Công thức hóa chất	Đơn vị	Số lượng
1	NaNO₃	mg	150
2	NaHPO₄	mg	8,69
3	Ferric EDTA	mg	10
4	MnCl₂	mg	0,22
5	CoCl₂	mg	0,11
6	CuSO₄.5H₂O	mg	0,0196
7	ZnSO₄.7H₂O	mg	0,044
8	Na₂SiO₃.9H₂O	mg	60
9	Na₂MoO₄.2H₂O	mg	0,012
10	B₁₂	µg	1,0
11	Biotin	µg	1,0
12	Thiamine HCL	mg	0,2

Để đơn giản và thuận tiện cho việc pha chế môi trường nuôi, các dung dịch gốc có nồng độ đậm đặc được chuẩn bị riêng rẽ trong các bình thuỷ tinh tối mầu nhằm sử dụng lâu dài. Từng thành phần đa lượng, các kim loại vi lượng được pha riêng và nồng độ pha gấp 1000 lần công thức môi trường. Lượng dùng: 1ml mỗi dung dịch gốc cho 1 lít nước nuôi. Tất cả các dung dịch gốc đều được đun sôi tiệt trùng và bảo quản trong điều kiện lạnh, tối, duy trì chất lượng và sử dụng trong vòng thời hạn 3 tháng. Trước khi sử dụng môi trường dinh dưỡng cho quá trình nuôi cấy bổ sung vitamin khi cần thiết.

+ Vệ sinh dụng cụ thí nghiệm

Các dụng cụ chuẩn bị cho quá trình lưu giữ làm từ vật liệu thuỷ tinh (bình tam giác 100ml, bình tam giác 250ml) được tiệt trùng bằng tủ sấy dụng cụ ở nhiệt độ 121^oC theo 3 chu kỳ tự động. Các dụng cụ phục vụ cho quá trình lưu giữ và nuôi giống thứ cấp (bình thuỷ tinh tam giác 1 L, bình cầu 2 L, bình cầu 5 L và bình cầu 10 L) được tiệt trùng đồng thời trong quá trình đun nước biển để nuôi cấy trở lại.

Các bình nhựa 20L, ống thủy tinh thổi khí dùng để nuôi sinh khối được rửa sạch và tiệt trùng đồng thời với quá trình tiệt trùng nước nuôi bằng chlorine có nồng độ 100ppm.

+ Xác định mật độ tế bào:

Mật độ tế bào là chỉ tiêu đánh giá quá trình sinh trưởng của quần thể vi tảo theo thời gian. Mật độ tế bào được xác định bằng buồng đếm hồng cầu (Neubauer improved của Đức), dưới kính hiển vi quang học (Hund Wetzlar với độ phóng đại 400 lần.

Mật độ tế bào được tính theo công thức:

D (tb/ml) = A × 10⁴

Trong đó: D là mật độ tế bào cần đếm (tb/ml)

A là tổng số tế bào đếm được trong ô E.

Vị trí buồng đếm

Hình 1: Buồng đếm hồng cầu

3.2.2. Lưu giữ giống

3.2.2.1. Chuẩn bị giống

Sau khi vi tảo được đưa từ môi trường thạch agar nuôi trong các bình thuỷ tinh tam giác 100 ml, nút kín bằng bông không thấm nước đã được sấy tiệt trùng để tránh vi khuẩn và động vật nguyên sinh xâm nhập.

Các điều kiện nuôi: độ mặn 27‰, nhiệt độ 25^oC, chu kỳ chiếu sáng liên tục nhưng cách xa dàn bóng đèn compac 20W từ 10- 20 cm.

Chăm sóc: lắc hằng ngày 3-4 lần trong các thể tích nhỏ 100 ml và 250 ml. Khi mật độ vi tảo đạt yêu cầu thì tiến hành cấy chuyển sang thể tích 1 lít có sục khí liên tục. Tùy theo yêu cầu số lượng giống giữ mà tiến hành cấy chuyển tiếp sang các thể tích khác nhau. Trước khi lưu giữ, từng loài vi tảo được kiểm tra dưới kính hiển vi để đảm bảo yêu cầu chọn giống. Những mẫu không đạt yêu cầu để chọn cho quá trình giữ giống thì loại bỏ.

3.2.2.2. Thực hiện lưu giữ giống 05 loài vi tảo

Mẫu vi tảo giống được chọn lựa dựa vào đặc điểm của từng đối tượng và mật độ, sau đó vi tảo giống được chuyển vào dung dịch môi trường mới (độ mặn 27‰) trong các bình tam giác nhỏ (100 và 250 ml). Mật độ vi tảo dùng để đem nuôi cấy được cho tại bảng 1. Đặt các bình chứa mẫu vi tảo đem cấy giống dưới ánh sáng với cường độ như khi nuôi giống trong các thể tích lớn

Sử dụng agar tinh khiết có bổ sung môi trường dinh dưỡng theo điều chỉnh tỷ lệ N/P tùy theo từng loài. Tỷ lệ agar là 15g/ 1lít nước biển nuôi, bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng là 5 ml cho 1 L nước biển nuôi có độ mặn 27‰. Khuấy đều, đun sôi cho tan hết agar sau đó tiệt trùng bằng cách cho hấp ướt hoặc sấy khô trong các dụng cụ chuyên dùng đều được. Sau khi agar sử lý tiệt trùng xong thì để nguội bớt rồi bổ sung vitamin B₁ và B₁₂ trước khi đổ agar ra đĩa cấy.

- Dùng đĩa Petri: rót thạch đã tiệt trùng vào đĩa Petri sao cho độ dày của agar trong đĩa là 3 mm, chờ cho agar đông lại thì lật ngược đĩa lại để cho bề mặt agar được khô khi cấy vi tảo lên. Toàn bộ quá trình trên được thao tác trong tủ cấy vi sinh đảm bảo tiệt trùng. Sau khi để agar trong tủ cấy trong vòng 24 – 48 giờ thì tiến hành cấy vi tảo lên trên bề mặt thạch.

Bảng 1. Mật độ vi tảo dùng để cấy lưu giữ trên thạch agar

Chỉ tiêu	N.oculata	I. galbana	C. calcitrans	C.muelleri	T. pseudonana
Mật độ	25 – 28.10⁶	12 – 14.10⁶	8 – 10.10⁶	6 – 8.10⁶	6 – 8.10⁶

3.2.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu đánh giá trong quá trình lưu giữ là: sự sống sót của giống, độ thuần, mật độ, trạng thái, màu sắc của tế bào vi tảo theo thời gian.

Chỉ tiêu đánh giá khả năng sinh trưởng của các loài vi tảo khi tái phát triển là mật độ cực đại và thời gian đạt mật độ cực đại.

Trên môi trường thạch cần xác định thời gian cần để các dòng vi tảo có màu đậm nhất và thời gian giữ được giống là bao lâu trong cả quá trình lưu giữ và tái phát triển.

3.2.3. Thử nghiệm nhân nuôi giống

3.2.3.1. Tảo Nannochloropsis oculata

- Điều kiện thí nghiệm: Vi tảo được nuôi trong các bình nhựa 20L, mật độ vi tảo ban đầu thí nghiệm là 5 triệu tb/ml, nhiệt độ môi trường dao động 25 – 28⁰ C, độ mặn 27‰, chiếu sáng theo chu kỳ 24/24h, sục khí liên tục.